Modeling Astrocytoom Pathogenese<em> In Vitro</em> En<em> In Vivo</em> Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Astrocytomen zijn de meest voorkomende primaire hersentumor en glioblastoma (GBM), een graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve subtype met een mediane overleving van 12-15 maanden 1,2. Invasie van diffuse astrocytomen, vooral GBM, verzet zich tegen volledige chirurgische resectie, beperkt de effectiviteit van adjuvante therapie, en leidt onvermijdelijk tot na de behandeling herhaling 3. Patiënten die aanvankelijk aanwezig, hetzij met de novo (primaire) GBM of met lagere rang astrocytomas die onvermijdelijk vordert naar (secundaire) GBM 4. GBM is genomisch heterogeen en gekenmerkt door elkaar uit en co-voorkomende mutaties in genen die drie belangrijke signaalwegen geregeld: de G1 / S (Rb) celcyclus, receptor tyrosine kinase (RTK) en TP53 pathways 5-7. GBM bestaat uit vier genomische subtypen met verschillende expressie profielen die verschillende hersengebieden celtypes lijken, wat suggereert dat de GBM subtype is Inflube- stuurders door de cel van oorsprong 6,8,9. Betere astrocytoma modellen moeten de rol van specifieke combinaties van mutaties in bepaalde celtypen tijdens astrocytoom pathogenese definiëren. Gebruikmakend van deze modellen voor efficiëntere preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen zal uiteindelijk helpen bij het verbeteren van patient outcomes. Huidige astrocytoom modellen zijn zowel gevestigde menselijke cellijnen, patiënt afgeleid xenograften (PDX), genetisch gemodificeerd normale menselijke astrocyten en neurale stamcellen (NSC), en genetisch gemanipuleerde muizen (GEM) 10-14. Ontwikkelden we een alternatieve, niet-kiembaan GEM (nGEM) model 15 met behulp van primaire hersencellen – corticale astrocyten en NSC – geoogst van GEM herbergen verschillende combinaties van floxed oncogene allelen. Het doel was om astrocytoma modellen met genetische gedefinieerde cellen die fenotypisch kan worden gekarakteriseerd in vitro pt in vivo en mogelijk gebruikt voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen in i genererenmmune-competente muizen.
Gevestigde humane cellijnen zijn de meest gebruikte model van astrocytoma pathogenese en drugs respons in vitro pt in vivo. Zijn technisch eenvoudig, algemeen beschikbaar en zijn kinetiek en tumorigeniciteit bij orthotope xenografting gedefinieerd in immunodeficiënte muizen 10,11,16-18 . Hun nadelen zijn het onvermogen om gevestigde cellijnen van low-grade astrocytomen genereren, studie alleen om high-grade astrocytomen beperken; ontbreken van een bepaald cel van oorsprong; de aanwezigheid van complexe genomische afwijkingen, vaak genomic profielen die sterk afwijken van het oorspronkelijke bloedmonster; en gevoeligheid voor fenotypische en genotypische drift tijdens seriële cultuur in serum 11,17,19-22. De fenotypische gevolgen van individuele oncogene mutaties in bestaande humane GBM cellijnen kunnen worden gemaskeerd door de veelheid van afwijkingen die daadwerkelijk aanwezig zijn, die vaak uitsluit elucidation rechtstreeks genotype-fenotype gevolgen.
PDX worden opgewekt door subcutane passage van patiënt geïsoleerd astrocytoom cellen in immunodeficiënte muizen of door hun cultuur als niet-hechtende sferoïden in gedefinieerd serumvrij medium voordat orthotope injectie in de hersenen van immunodeficiënte muizen 12,23. PDX nauwkeuriger handhaven de genomische landschap van menselijke astrocytoma, maar vergelijkbaar met gevestigde humane cellijnen, kan het fenotypisch effect van afzonderlijke oncogene mutaties worden gemaskeerd door hun genomische complexiteit 19,24. De fenotypische gevolgen van specifieke oncogene mutaties definiëren, met name in reactie op nieuwe therapieën, zijn platen van gevestigde humane cellijnen of PDX vaak gebruikt om genotype-fenotype correlaties tonen generaliseerbaarheid en de kans cellijn-specifieke effecten te minimaliseren. Terwijl PDX nauwkeurig recapituleren de histopathologische kenmerken van de menselijke astrocytomas, incLuding invasie, orthotopische xenograften van gevestigde menselijke cellijnen algemeen niet 21,23,25. Bovendien normale humane astrocyten en NSC zijn genetisch gemanipuleerd met gedefinieerde oncogene mutaties model astrocytoma tumorigenese in vitro pt in vivo 13,14,26. Deze cellen missen het genomische complexiteit van gevestigde humane cellijnen en PDX en nauwkeurig herhalen menselijke astrocytoma histopathologie, maar vereisen xenografting in immunodeficiënte knaagdieren in vivo. Omdat alle menselijke celmodellen nodig immunodeficiënte knaagdiergastheren immuungemedieerde xenograft afstoting te voorkomen, deze modellen niet de natieve tumor-stroma interacties van een syngene systeem recapituleren en missen een intact immuunsysteem, beperken preklinische onderzoek-stroma gerichte en immuun-modulerende therapieën 10,11.
GEM vergunning onderzoek van de fenotypische gevolgen van voorafbepaalde combinaties van oncogene mutaties in vivo tijdens in situ het ontstaan van tumoren. Terwijl niet-conditionele GEM hebben mutaties in alle weefsels tijdens de ontwikkeling, kennen voorwaardelijke GEM oncogene allelen waarmee targeting van mutaties door het beperken Cre gemedieerde recombinatie specifieke celtypen door gebruik van celtype-specifieke promoters 10,11,15,18 floxed. Voorwaardelijke astrocytoma GEM zijn gebruikt om de functionele rol van oncogene mutaties in verschillende celtypes ophelderen binnen een intacte hersenen 11. De preklinische nut van in situ gliomagenesis die voorwaardelijke GEM wordt beperkt door een aantal factoren, waaronder 1) het ontbreken van een in vitro correlaat, 2) moeilijkheden bij het genereren van grote cohorten van muizen met complexe genotypes, 3) lange latentie van in situ tumorontwikkeling , 4) en stochastische tumorprogressie. Omdat in situ tumorigenese mist een overeenkomstige in vitro model, drug testen in vitro kan worden uitgevoerd with conventionele voorwaardelijke GEM modellen. In tegenstelling tot andere kankers zijn voorwaardelijke GEM modellen van astrocytomen zelden geïnduceerd door enkele oncogene mutaties 11. Zo worden complexe fokprogramma's nodig om voorwaardelijke GEM met meerdere oncogene mutaties te genereren. Bovendien astrocytoma initiatie optreedt met variabele penetrantie na een lange latentieperiode in deze modellen, terwijl progressie naar hooggradige astrocytomen treedt meestal in een niet-uniforme, stochastische wijze en uiteindelijk leidt tot tumoren met complexe genomische landschappen en snelle groei kinetiek 27, 28. De variabele penetrantie en stochastische aard van kwaadaardige progressie in voorwaardelijke GEM modellen vereist dat individuele muizen worden gescreend door radiografische beeldvorming om de aanwezigheid en locatie van high-grade astrocytomen detecteren vóór hun inschrijving in preklinisch geneesmiddelenonderzoek. Tezamen bieden deze beperkingen belemmeren het genereren en testen van de grote cohorten van voorwaardelijke GEM nodig voor preClinical drugstests.
De RCAS-tva GEM-systeem, waarbij aviaire retrovirale (RCAS) vectoren gebruikt om GEM ontwikkeld om de virale receptor (tva) over specifieke neurale celtypes uiten infecteren, is uitgebreid gebruikt om het model astrocytoom tumorvorming 11. In tegenstelling tot voorwaardelijke GEM, dit modelsysteem maakt introductie van meerdere oncogene mutaties in specifieke celtypen zonder de noodzaak voor complexe fokprogramma's. Wordt echter beperkt door variabele penetrantie het vereiste van actief delende cellen virale integratie en de willekeurige insertie van transgenen in het gastheergenoom 29.
Non-kiemlijn GEM (nGEM) modellen die cellen geoogst GEM gebruiken, wordt steeds belangrijker omdat overwinnen veel van de beperkingen van andere modelsystemen 15. De rol initiëren celtype en co-voorkomende mutaties in astrocytoma pathogenese moeilijk te ontmoedigenmijne met behulp van bestaande humane GBM cellijnen of PDX omdat ze zijn afgeleid van het eindstadium van tumoren die uitgebreide genetische mutaties in undefined celtypen hebben opgebouwd in de loop van kwaadaardige progressie. Daarentegen kunnen alle soorten astrocytomen worden gemodelleerd met nGEM door het induceren gedefinieerde genetische mutaties binnen bepaalde gezuiverde hersenen celtypen 11,30. Aldus kan de invloed van specifieke genetische mutaties en celtype over cellulaire en moleculaire fenotypes worden bepaald in vitro pt in vivo. Vergelijkbaar met bestaande humane GBM cellijnen, kan in eerste instantie in vitro drug testen met behulp nGEM worden gebruikt om drugs voor in vivo onderzoek met behulp van dezelfde cellen te prioriteren. Tumorigenese in vivo kan dan worden bepaald door allografting nGEM orthotopically cellen in de hersenen van immuuncompetente syngene nestgenoten 30. Deze orthotopische allogreffe modellen toestaan daarom in vivo testen, niet alleen van conventionele cytotoxische eennd gerichte therapieën, maar immuun-modulerende en stroma-gerichte therapieën ook. Tenslotte kan de rol van het micromilieu op tumor initiatie en progressie worden bepaald door vergelijking van resultaten tussen nGEM en conventionele GEM modellen met dezelfde mutaties in dezelfde cel types.
Wij en anderen hebben astrocytoom nGEM ontwikkeld met behulp van primaire cellen – astrocyten, NSC, of oligodendrocyte voorloper cellen (OPC) – geoogst van GEM 30-34. De reden voor de ontwikkeling van een astrocytoom nGEM was een model om de fenotypische gevolgen van oncogene mutaties in specifieke celtypen die zouden kunnen worden gebruikt voor preklinisch onderzoek drug in vitro pt in vivo in immuuncompetente dieren vast te maken. We geoogst fenotypisch WT corticale astrocyten en NSC uit niet-Cre uiten voorwaardelijke GEM gehandhaafd op een> 94% C57 / Bl6 achtergrond met floxed RB pad – Rb1 loxP / loxP of TgGZT121 – en floxed RTK / RAS / PI3K – Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP – genen in verschillende combinaties 35-39. We geïnduceerde genetische recombinatie in vitro met adenovirale vectoren die coderen voor Cre recombinase. Omdat corticale astrocyten oogsten bevatten een mengsel van celtypen, gebruikten we Ad5GFAPCre vectoren of dominante oncogene transgenen, zoals TgGZT 121 gedreven uit de menselijke GFAP promotor, te verrijken voor GFAP + corticale astrocyten in deze culturen. Wij hebben de fenotypische gevolgen van G1 / S (Rb), MAPK en PI3K mutaties in corticale astrocyten en NSC in vitro pt in vivo. MAPK en PI3K-route geactiveerd G1 / S-defecte astrocyten moleculair nagebootste menselijke proneural GBM en na orthotope injectie gevormde tumoren in een vooraf gedefinieerde locatie uniforme groeikinetiek korte latencies en de histopathologischeal kenmerken van de menselijke GBM 30. Longitudinale monitoring van tumorgroei in vivo bevordert preklinische testen geneesmiddel door normalisering behandeling cohorten en kwantitatieve analyse van tumorgroei in respons op de behandeling 40. We bepaald tumorgroei kinetiek door longitudinale bioluminescentie beeldvorming van muizen geïnjecteerd met luciferase uiten corticale astrocyten. Daarom corticale astrocyten en NSC afgeleid van voorwaardelijke GEM zorgen voor een soepel model systeem voor de bepaling van de functionele gevolgen van-astrocytoom-geassocieerde mutaties en een potentiële modelsysteem voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor een goede oogst en cultuur van corticale astrocyten 1) waarborgen de cortex te snijden zonder het weefsel onder het corpus callosum, 2) de hersenvliezen verwijderd, 3) grondig dissociëren van de cellen en 4) te verrijken voor GFAP + astrocyten. Hoewel we gebruikt mechanische (schudden) en genetische (beperking van genetische recombinatie met een Ad5GFAPCre vector of het gebruik van een dominante transformerende transgen (TgGZT 121) onder GFAP promo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
Referências
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
- Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
- . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
- Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
- Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
- Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
- Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
- Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
- Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
- Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
- Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
- Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
- Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
- Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
- McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
- Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
- Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
- Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
- Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
- Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
- Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
- Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
- Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).
