Modellierung Astrozytom Pathogenese<em> In-vitro-</em> Und<em> In Vivo</em> Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrozytome sind die häufigsten primären Hirntumoren und Glioblastom (GBM), ein Astrozytom Grad IV, ist die häufigste und aggressive Subtyp mit einer medianen Überlebensrate von 12-15 Monaten ^1,2. Invasion diffuse Astrozytome, insbesondere GBM, schließt die vollständige chirurgische Resektion, begrenzt die Wirksamkeit der adjuvanten und führt zwangsläufig zu Nachbehandlung Wiederholung ^3. Patienten, die ursprünglich vorhanden entweder mit de novo (primären) GBM oder mit niedrigeren Astrozytomen, die unweigerlich fortschreitet, um (sekundär) ⁴ GBM. GBM ist genomisch heterogen und durch sich gegenseitig ausschließende und Co-vorkommende Mutationen in Genen, die drei Hauptsignalwege geregelt gekennzeichnet: der G ₁ / S (Rb) Zellzyklus-Kontrollpunkt, Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) und TP53 Pfade ^5-7. GBM besteht aus vier Subtypen mit unterschiedlichen genomischen Expressionsprofile, die verschiedenen Hirnzelltypen ähneln, was darauf hindeutet, dass GBM-Subtyp ist beeindurch seine Ursprungszelle ^6,8,9 beeinflusst. Besser Astrozytom Modelle erforderlich sind, um die Rolle von spezifischen Kombinationen von Mutationen in bestimmten Zelltypen während Astrozytom Pathogenese definieren. Nutzt diese Modelle für effizientere präklinischen Arzneimittelentwicklung wird letztlich helfen, Patienten zu verbessern. Aktuelle Astrozytom Modelle zählen etablierte humane Zelllinien, Patienten abgeleitet Xenografts (PDX), gentechnisch veränderte normalen menschlichen Astrozyten und neuronalen Stammzellen (NSC), und gentechnisch veränderte Mäuse (GEM) ^10-14. Wir entwickelten eine alternative, nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modell ¹⁵ Nutzung von Primärgehirnzellen – kortikalen Astrozyten und NSC – von GEM beherbergen verschiedene Kombinationen von floxed onkogenen Allele geerntet. Das Ziel war, Astrozytom Modelle mit genetisch definierten Zellen, die phänotypisch sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt charakterisiert werden konnte und möglicherweise für die präklinische Entwicklung von Arzneimitteln in i erzeugenmmune kompetenten Mäusen.

Etablierten humanen Zelllinien sind die am häufigsten verwendete Modell der Pathogenese Astrozytom und Drogenantwort in vitro und in vivo. Sie sind technisch unkompliziert, überall verfügbar und wurden Kinetik und Tumorbildung bei orthotopen xenografting in immundefizienten Mäusen ^10,11,16-18 definiert . Ihre Nachteile sind die Unfähigkeit, etablierte Zelllinien von Low-grade-Astrozytome erzeugen, die Begrenzung Studie nur auf High-Astrozytome; Mangels einer definierten Ursprungszelle; die Anwesenheit von komplexer genomischer Anomalien, häufig mit genomischen Profile, die sich deutlich von der ursprünglichen Patientenprobe unterscheiden; und die Anfälligkeit für phänotypische und genotypische Drift während Serienkultur in Serum ^11,17,19-22. Die phänotypische Folgen der einzelnen onkogenen Mutationen in etablierten humanen Zelllinien können GBM durch die Vielzahl von Anomalien, die tatsächlich vorhanden sind, die oft entgegensteht eluc maskiert werdendierung der direkten Genotyp-Phänotyp-Folgen.

PDX durch subkutane Gang von Patienten isoliert Astrozytomzellen in immundefizienten Mäusen oder durch die Kultur als nichthaft Sphäroide in definierten, serumfreien Medium vor der orthotopen Injektion in das Gehirn von immundefizienten Mäusen ^12,23 erzeugt. PDX genauer Aufrechterhaltung der genomischen Landschaft der menschlichen Astrozytomen, aber ähnlich etablierten humanen Zelllinien kann die phänotypische Wirkung einzelner onkogenen Mutationen aufgrund ihrer genomischen Komplexität ^19,24 maskiert werden. Um die phänotypischen Auswirkungen von spezifischen Mutationen onkogenen insbesondere als Reaktion auf neue Therapien zu definieren, werden Platten aus etablierten humanen Zelllinien oder PDX häufig verwendet, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen zu etablieren, zeigen Generalisierbarkeit und die Wahrscheinlichkeit von Zelllinie spezifische Effekte zu minimieren. Während PDX genau rekapitulieren die histopathologische Kennzeichen der menschlichen Astrozytomen, incLuding Invasion orthotopen Xenografts von etablierten humanen Zelllinien in der Regel nicht ^21,23,25. Zusätzlich normalen menschlichen Astrozyten und NSC wurden mit definierten onkogenen Mutationen gentechnisch zu Astrozytom Tumorgenese in vitro und in vivo ^13,14,26 modellieren. Diesen Zellen fehlt die genomische Komplexität der etablierten humanen Zelllinien und PDX und Menschen Astrozytom Histopathologie genau rekapitulieren, erfordern aber xenografting in immundefizienten Nagern in vivo. Da alle menschlichen Zellmodelle erfordern immundefiziente Nager Hosts immunvermittelte Abstoßung von Xenotransplantaten zu verhindern, sind diese Modelle nicht den nativen Tumor-Stroma-Interaktionen einer syngenen System rekapitulieren und es fehlt ein intaktes Immunsystem Begrenzungs präklinischen Untersuchung von Stroma-bezogenen und immunmodulatorischen Therapien ^10,11.

GEM Genehmigung Untersuchung der phänotypischen Folgen der vorgegebenen Kombinationen von onkogenen mutagen in vivo während der Tumorgenese in situ. Während nicht-bedingten GEM Mutationen in allen Geweben während der Entwicklung haben bedingten GEM onkogenen Allele, die Targeting von Mutationen durch Beschränkung Cre-vermittelte Rekombination an spezifische Zelltypen durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren ^10,11,15,18 ermöglichen floxed. Bedingte Astrozytom GEM wurden verwendet, um die funktionelle Rolle von onkogenen Mutationen in verschiedenen Zelltypen in einer intakten Gehirn ¹¹ zu erläutern. Das präklinische Nützlichkeit in situ gliomagenesis mit bedingtem GEM wird durch eine Anzahl von Faktoren, einschließlich 1) das Fehlen eines in vitro-Korrelat, 2) Schwierigkeiten bei der Erzeugung von großen Kohorten von Mäusen mit komplexen Genotypen, 3) mit langer Latenzzeit von in situ Tumorentwicklung limitiert , 4) und stochastische Tumorprogression. Da in situ Tumorentstehung fehlt eine entsprechende in-vitro-Modell, können Drogentests in vitro nicht w durchgeführt werdenit herkömmlichen bedingten GEM-Modelle. Im Gegensatz zu anderen Krebsarten, sind bedingte GEM-Modelle von Astrozytomen selten von einzelnen onkogenen Mutationen ¹¹ induziert. So werden komplexe Systeme benötigt, um Zucht bedingte GEM mit mehreren onkogenen Mutationen zu erzeugen. Darüber hinaus tritt Astrozytom Initiierung mit variabler Penetranz nach einer langen Latenzzeit in diesen Modellen, während das Fortschreiten zu hohen Astrozytomen erfolgt in der Regel in einer nicht gleichmäßigen, stochastische Weise und führt zu Tumoren mit komplexen genomischen Landschaften und das schnelle Wachstum Kinetik ^{27 letztlich 28.} Die variable Penetranz und stochastische Natur der malignen Progression in bedingten GEM Modelle erfordert, dass einzelne Mäuse durch Röntgenaufnahmen untersucht, um das Vorhandensein und die Lage von hochwertigen Astrozytome vor ihrer Einschreibung in präklinischen Studien nachzuweisen. Zusammengenommen sind diese Einschränkungen behindern die Erzeugung und Prüfung der großen Kohorten von bedingten GEM für PR erforderlicheClinical Drogentests.

Die RCAS-TVA GEM-System, das Vogelgrippe retroviralen (RCAS)-Vektoren verwendet, um GEM entwickelt, um die viralen Rezeptor (TVA) auf bestimmten neuronalen Zelltypen infizieren auszudrücken, wurde ausgiebig genutzt, um die Tumorgenese Astrozytom ¹¹ zu modellieren. Im Gegensatz zu bedingten GEM, ermöglicht dieses Modell die Systemeinführung von mehreren onkogenen Mutationen in bestimmten Zelltypen ohne das Erfordernis für komplexe Systeme Zucht. Es wird jedoch durch variable Penetranz der Anforderung aktiv teilenden Zellen, die virale Integration zu erreichen, und die zufällige Insertion von Transgenen in das Wirtsgenom ²⁹ begrenzt.

Nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modelle, die Zellen von GEM geerntet zu nutzen, werden immer wichtiger, weil sie zu überwinden viele der Einschränkungen von anderen Modellsystemen ^15. Die Rolle der Einleitung Zelltyp und Co-auftretende Mutationen in Astrozytom Pathogenese sind schwer davon abhaltenMine verwendet etablierten humanen Zelllinien oder GBM PDX, weil sie aus im Endstadium Tumoren, die umfangreichen genetischen Mutationen in undefinierten Zelltypen während des Verlaufs der malignen Progression angesammelt haben, abgeleitet. Im Gegensatz dazu können alle Sorten von Astrozytomen mit Ngem durch Induzieren definierten genetischen Mutationen in spezifischen gereinigten Gehirnzelltypen ^11,30 modelliert werden. Somit kann der Einfluss der spezifischen genetischen Mutationen und Zelltyp auf zelluläre und molekulare Phänotypen in vitro und in vivo bestimmt werden. Ähnlich etablierten humanen GBM-Zelllinien, können erste in-vitro-Wirkstoffprüfung mit Ngem verwendet werden, um Medikamente für in vivo-Tests unter Verwendung der gleichen Zellen zu priorisieren. Tumorentstehung in vivo kann dann durch Allotransplantation Ngem Zellen orthotopisch in die Gehirne von immunkompetenten syngenen Wurf ³⁰ bestimmt werden. Diese orthotopen Allograft-Modelle in-vivo-Tests nicht nur von konventionellen zytotoxischen eine Genehmigung dahernd zielgerichtete Therapien, aber immunmodulatorischen und Stroma-zielgerichtete Therapien auch. Schließlich kann die Rolle der Mikroumgebung auf Tumor Initiation und Progression durch den Vergleich der Ergebnisse zwischen Ngem und GEM herkömmlichen Modellen unter Verwendung der gleichen Mutationen in den gleichen Zelltypen bestimmt werden.

Wir und andere haben Astrozytom Ngem entwickelt unter Verwendung von primären Zellen – Astrozyten, NSC oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) – von GEM ^30-34 geerntet. Der Grund für die Entwicklung von einem Astrozytom Ngem war es, ein Modell, um die phänotypischen Folgen von onkogenen Mutationen in spezifischen Zelltypen, die möglicherweise für präklinischen Tests in vitro und in vivo in immunkompetenten Tieren verwendet werden könnte, zu bestimmen, zu erstellen. Wir ernteten phänotypisch WT kortikalen Astrozyten und NSC aus Nicht-Cre exprimieren, bedingte GEM auf einem> 94% C57 / Bl6 Hintergrund mit floxed RB Weg gepflegt – Rb1 ^{loxP / loxP} oder TgGZT121 – und floxed RTK / RAS / PI3K-Weg – Nf1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, Pten ^{loxP / loxP} – Gene in verschiedenen Kombinationen ^35-39. Wir induzierte genetische Rekombination in vitro unter Verwendung von adenoviralen Vektoren, die Cre-Rekombinase codiert. Da kortikalen Astrozyten Ernten ein Gemisch von Zelltypen, verwendeten wir Ad5GFAPCre Vektoren oder dominant onkogenen Transgene, wie TgGZT ₁₂₁ von der menschlichen GFAP-Promotor angetrieben wird, um für GFAP ⁺ kortikalen Astrozyten in diesen Kulturen zu bereichern. Wir definierten die phänotypischen Auswirkungen der G ₁ / S (Rb), MAPK und PI3K Mutationen in kortikalen Astrozyten und NSC in vitro und in vivo. MAPK und PI3K-Weg-Aktiv G1 / S-defekt Astrozyten molekular nachgeahmten menschlichen proneurale GBM und auf orthotope Injektion gebildet Tumoren in einer vordefinierten Stelle mit einheitlichen Wachstumskinetik, kurze Latenzzeiten und der histopathologischenal Markenzeichen der menschlichen GBM ^30. Längs Überwachung von Tumorwachstum in vivo unterstützt präklinischen Drogentests durch Normalisierung der Behandlung Kohorten und quantitative Analyse von Tumorwachstum in Reaktion auf die Behandlung ^40. Wir bestimmten Tumorwachstum Kinetik durch Längs Biolumineszenz-Bildgebung von Mäusen mit Luciferase kortikalen Astrozyten injiziert. Daher kortikalen Astrozyten und NSC aus bedingtem GEM abgeleitet eine gefügig Modellsystem für die Definition der funktionellen Konsequenzen Astrozytom-assoziierte Mutationen und einem potenziellen Modellsystem für die präklinische Wirkstoffentwicklung.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Universität von North Carolina Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Die Züchtung kortikale Astrozyten von neugeborenen Mäusen Vorbereitung Zerknittern 2-3 heikle Aufgabe Gewebe aufnehmen und in den Boden eines Kolbens gegeben, enthaltend 70% Ethanol. Zeigen Dissektionsscheren, gebogenen Pinzette und 2 Paar gerade Mikropinzette in diesen Kolben. Die Gewebe werden verwendet, um zu vermeiden, das Biegen der Mikropinzet…

Representative Results

Wir entwickelten ein Modellsystem mit Ngem kortikalen Astrozyten und NSC von Neugeborenen GEM Beherbergung geerntet floxed bedingten onkogenen Allele, die phänotypisch in vitro und in vivo charakterisiert werden können (Abbildung 1). Um die Folgen von onkogenen Mutationen insbesondere in kortikalen Astrozyten in vitro zu untersuchen, ist es wichtig, zunächst anreichern Astrozyten. Kortikalen Astrozyten Ernten enthalten eine Mischung von Mikrogliazellen, Astrozyten, Oligoden…

Discussion

Die wichtigsten Maßnahmen zur Gewährleistung der Ernte und Kultur der kortikalen Astrozyten 1) sicherzustellen, um den Kortex ohne Gewebe unterhalb des Balkens herauszuschneiden, 2), um die Hirnhaut zu entfernen, 3) vollständig zu dissoziieren, die Zellen, und 4), die für GFAP bereichern ⁺ Astrozyten. Obwohl wir verwendet mechanische (Zittern) und genetische (Einschränkung der genetischen Rekombination mit einem Ad5GFAPCre Vektor oder Nutzung einer beherrschenden Transformation Transgen (TgGZT _1…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Invitrogen	11995065	DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular	Cellgro	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4	Miltex	17-301
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2710
Razor Blades	VWR	55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Invitrogen	12605-010	Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
15 ml tubes	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	BD Biosciences	352070
Adenovirus stock	Gene Transfer Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)	Sigma-Aldrich	238597
Potassium sulfate (K2SO4)	Sigma-Aldrich	221325
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	746495
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
D-(+)- Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P3532
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Papain	Worthington	LS003127
L-Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size)	Millipore	SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse	Stemcell Technologies	5702	This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	Invitrogen	14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size)	Corning	352340
Stem cell dissociation solution	Stemcell Technologies	5707	Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X	Millipore	SLM-202-B	For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser	Hamilton	83700
Disposable 18 ga needles	Fisher Scientific	NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Betadine	Fisher Scientific	NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	Tissue adhesive
Lidocaine	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
Anti-Sox2	Millipore	AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122796	For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro	Addgene	18782