Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.
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Artigo de método
Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os modelos atuais de astrocitoma são limitados em sua capacidade de definir os papéis das mutações oncogênicas em tipos específicos de células cerebrais durante a patogênese da doença e sua utilidade para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. A fim de projetar um sistema modelo melhor para essas aplicações, astrócitos corticais de tipo fenotipicamente selvagem e células-tronco neurais (NSC) de camundongos geneticamente modificados condicionais (GEM) que abrigam várias combinações de alelos oncogênicos floxed foram colhidos e cultivados em cultura. A recombinação genética foi induzida in vitro usando recombinação mediada por Cre adenoviral, resultando na expressão de oncogenes mutantes e deleção de genes supressores de tumor. As consequências fenotípicas dessas mutações foram definidas medindo a proliferação, transformação e resposta a drogas in vitro. Modelos de aloenxerto ortotópico, em que as células transformadas são injetadas estereotáticamente no cérebro de irmãos de ninhada singênicos imunocompetentes, foram desenvolvidos para definir o papel das mutações oncogênicas e do tipo de célula na tumorigênese in vivo. Ao contrário da maioria dos xenoenxertos de linha celular de glioblastoma humano estabelecidos, a injeção de astrócitos corticais derivados de GEM transformados nos cérebros de irmãos de ninhada imunocompetentes produziu astrocitomas, incluindo o subtipo mais agressivo, glioblastoma, que recapitulou as características histopatológicas dos astrocitomas humanos, incluindo invasão difusa do parênquima cerebral normal. A imagem de bioluminescência de aloenxertos ortotópicos de astrócitos transformados projetados para expressar luciferase foi utilizada para monitorar o crescimento do tumor in vivo ao longo do tempo. Assim, modelos de astrocitoma usando astrócitos e NSC colhidos de GEM com alelos oncogênicos condicionais fornecem um sistema integrado para estudar a genética e a biologia celular da patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo e podem ser úteis no desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos para essas doenças devastadoras.
Introdução
Astrocitomas são o tumor cerebral primário mais comum e glioblastoma (GBM), a IV astrocitoma grau, é o subtipo mais comum e agressivo, com uma sobrevida média de 12-15 meses 1,2. Invasão de astrocitomas difusos, particularmente GBM, opõe-se a ressecção cirúrgica completa, limita a eficácia de terapias adjuvantes, e inevitavelmente leva a recorrência pós-tratamento 3. Inicialmente, os pacientes apresentam, quer com de novo (primário) GBM ou com astrocitoma grau menor que inevitavelmente progride para GBM (secundário) 4. GBM é genomicamente heterogêneo e caracterizado por mutações que se excluem mutuamente e que co-ocorrem em genes que ....
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Protocolo
Todos os estudos com animais foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte Animal Care Institucional e Comitê de Uso.
1 A cultura Cortical astrócitos de Neonatal Ratos
- Preparação
- Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados para evitar entortar os micro fórceps.
- Adicionar 1 ml de HBSS a 60 milímetros uma cultura de tecidos de. Prepara-se uma placa separada para cada animal e manter pratos sobre gelo.
- Anestesiar animais po....
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Resultados
Foi desenvolvido um sistema de modelo nGEM com astrócitos corticais e NSC colhidas de abrigar GEM neonatal floxed alelos oncogênicos condicional que pode ser fenotipicamente caracterizados in vitro e in vivo (Figura 1). A fim de investigar os efeitos de mutações oncogénicas especificamente em astrócitos do córtex in vitro, que é crítico para o primeiro enriquecimento em astrócitos. Colheitas de astrócitos corticais conter uma mistura de microglia, astrócitos, oligodendrócitos, neurónio.......
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Discussão
Os passos mais críticos para assegurar a colheita e a cultura de astrócitos do córtex são 1) adequada para excisar o córtex sem tomar tecido abaixo do corpo caloso, 2) para remover as meninges, 3) para dissociar completamente as células, e 4) para o enriquecimento para a GFAP + astrócitos. Embora utilizando mecânica (agitação), e genética (restrição de recombinação genética com um vector Ad5GFAPCre ou utilização de um transgene transformadora dominante (TgGZT 121) sob o controlo do promoto.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
CRM é um Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. Este trabalho foi apoiado, em parte, por doações ao CRM da Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Departamento de Defesa (W81XWH-09-2-0042) e Fundo de Pesquisa do Câncer da Universidade da Carolina do Norte (UCRF). Os autores gostariam de agradecer a Daniel Roth pela assistência na criação de ratos. Os autores também gostariam de agradecer a Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette e Susannah Krom pela assistência na cultura de tecidos e imunofluorescência.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| O Meio de Águia Modificado (DMEM) (1X) da Dulbecco | Invitrogen | 11995065 | DMEM também pode ser adquirido de outros fornecedores, incluindo GIBCOSigma e Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Tesoura de Dissecação de Ponta Afiada | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Pinça de Polegar de Cartilagem, Curvada | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Estilo 1 Pinça de Joalheiro, Fina, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Etanol (200 provas) | Lâminas de Barbear Decon Labs | 2710 | |
| VWR | 55411-050 | ||
| Solução de Sal Balanceada Hanks (HBSS) (1x), líquido | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1x), Fenol Vermelho | Invitrogen | 12605-010 | Outras soluções de tripsina também são adequadas para astrócitos corticais e cultura |
| Prato de Cultura, 60 x 15 mm | Tubos Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml BD | Biosciences | 352096 | |
| Tubos de 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| Estoque de adenovírus | Transferência de genes Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store em 5 µ l alíquotas a -80 °C. Perigoso. Use as precauções de segurança Bsl2 |
| Sulfato de sódio (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Sulfato de potássio (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES sal | de potássioSigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Vermelho de Fenol | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cisteína-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| (0.22 µ m tamanho dos poros) | Millipore | SLGP033NS | |
| Kit de proliferação Neurocult, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | Este kit contém o suplemento NeuroCult NSC Basal Medium e NeuroCult NSC necessário para a cultura NSC |
| 0,2% Solução de heparina | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Faça estoque de 10 mM em DMSO, armazene a -20 ° C |
| Placas de 6 poços | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Filtro de células (40 µ tamanho do poro m) | Corning | 352340 | |
| Solução de dissociação de células-tronco | Stemcell Technologies | 5707 | Alternativamente, use soluções enzimáticas suaves como Accutase |
| Metilcelulose 15 | cP Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x | Millipore | SLM-202-B | Para fazer solução de metilcelulose a 5% |
| 1,7 ml Snap Cap Tubo de Microcentrífuga | Corning | 3620 | |
| Seringa Hamilton, 250 µ l LT sem agulha | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Hamilton | 83700 | ||
| Agulhas descartáveis de 18 G | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" agulha de ponta luer | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Pomada Oftálmica | Fisher Scientific | ||
| Quadro Estereotáxico Modelo 900 | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Adesivo de tecido |
| Lidocaína | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQuo One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Proteína Ácida Anti-Glial Anti-Glial de Coelho Policlonal (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | Para in vivo | |
| imagem D-Luciferina - Substrato Bioluminescente de Sal K+ | PerkinElmer | 122796 | Para in vivo imagem de bioluminescência |
| Kit de imagem EdU | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
Referências
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al.
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Reimpressões e permissões
