मॉडलिंग तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन<em> इन विट्रो</em> और<em> इन विवो</em> Cortical Astrocytes या सशर्त, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Astrocytomas सबसे आम प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर और ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), एक ग्रेड चतुर्थ तारिकाकोशिकार्बुद हैं, 12-15 महीने 1,2 के एक औसत अस्तित्व के साथ सबसे आम और आक्रामक उप प्रकार है. फैलाना astrocytomas, विशेष रूप से जीबीएम के आक्रमण, पूरा शल्य लकीर precludes सहायक उपचार की प्रभावशीलता को सीमित करता है, और अनिवार्य रूप से उपचार के बाद पुनरावृत्ति 3 की ओर जाता है. डी नोवो (प्राथमिक) जीबीएम साथ या अनिवार्य रूप से (माध्यमिक) जीबीएम 4 की प्रगति कि कम ग्रेड astrocytomas साथ या तो शुरू में उपस्थित मरीजों. जीबीएम genomically विषम और तीन कोर संकेत दे रास्ते को नियंत्रित करने वाले जीन में परस्पर अनन्य और सह होने वाली म्यूटेशन की विशेषता है: जी 1 / एस (आरबी) सेल चक्र जांच की चौकी, रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK), और TP53 5-7 रास्ते. जीबीएम जीबीएम उप influ है, सुझाव है कि विभिन्न मस्तिष्क कोशिका प्रकार के सदृश कि विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ चार जीनोमिक उपप्रकार होते हैंमूल 6,8,9 के अपने सेल द्वारा enced. बेहतर तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन दौरान विशेष प्रकार की कोशिकाओं में उत्परिवर्तन के विशिष्ट संयोजन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं. अधिक कुशल पूर्व नैदानिक दवा के विकास के लिए इन मॉडलों का इस्तेमाल अंततः रोगी परिणामों में सुधार करने में मदद करेगा. वर्तमान तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल मानव कोशिका लाइनों, रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDX), आनुवंशिक रूप से संशोधित सामान्य मानव astrocytes और तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों (मणि) 10-14 स्थापित करना शामिल है. कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी – – floxed oncogenic alleles के विभिन्न संयोजनों को शरण देने मणि से काटा हम प्राथमिक मस्तिष्क की कोशिकाओं के उपयोग के लिए एक वैकल्पिक, गैर germline मणि (nGEM) मॉडल 15 विकसित की है. लक्ष्य phenotypically मैं में पूर्व नैदानिक दवा के विकास के लिए इन विट्रो में और vivo में दोनों की विशेषता है और संभावित उपयोग किया जा सकता है कि आनुवंशिक रूप से परिभाषित कोशिकाओं के साथ तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया थाmmune-सक्षम चूहों.
स्थापित मानव कोशिका लाइनों वे सीधे आगे, तकनीकी रूप से व्यापक रूप से उपलब्ध हैं. तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन और इन विट्रो में और vivo में दवा प्रतिक्रिया का सबसे अधिक इस्तेमाल मॉडल हैं, और immunodeficient चूहों 10,11,16-18 में Orthotopic xenografting पर कैनेटीक्स और tumorigenicity परिभाषित किया है . उनके नुकसान केवल उच्च ग्रेड astrocytomas के लिए अध्ययन सीमित कम ग्रेड astrocytomas से स्थापित सेल लाइनों उत्पन्न करने में असमर्थता शामिल हैं; मूल के एक परिभाषित सेल की कमी; अक्सर मूल रोगी नमूना से स्पष्ट रूप से भिन्न है कि जीनोमिक प्रोफाइल के साथ जटिल जीनोमिक असामान्यताएं, की उपस्थिति; और संवेदनशीलता सीरम 11,17,19-22 में सीरियल संस्कृति दौरान प्ररूपी और genotypic बहाव को. स्थापित मानव जीबीएम सेल लाइनों में व्यक्तिगत oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणाम अक्सर eluc precludes जो वास्तव में उपस्थित हैं कि असामान्यताएं, की भीड़ द्वारा नकाबपोश जा सकता हैप्रत्यक्ष जीनोटाइप-phenotype के परिणामों की idation.
PDX immunodeficient चूहों में या immunodeficient चूहों 12,23 के दिमाग में orthotopic इंजेक्शन से पहले परिभाषित, सीरम मुक्त माध्यम में गैर पक्षपाती spheroids के रूप में अपनी संस्कृति के माध्यम से रोगी पृथक तारिकाकोशिकार्बुद कोशिकाओं के चमड़े के नीचे पारित होने के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं. PDX अधिक सही मानव astrocytomas के जीनोमिक परिदृश्य को बनाए रखने, लेकिन स्थापित मानव कोशिका लाइनों के लिए इसी तरह, व्यक्तिगत oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी प्रभाव उनके जीनोमिक जटिलता 19,24 के कारण नकाबपोश जा सकता है. विशेष रूप से उपन्यास के उपचारों के जवाब में, विशिष्ट oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणामों को परिभाषित करने के लिए, स्थापित मानव कोशिका लाइनों या PDX के पैनल अक्सर, जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध स्थापित generalizability दिखाने के लिए, और सेल लाइन विशेष प्रभाव की संभावना को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है. PDX सही मानव astrocytomas, इंक के histopathological पहचान पुनरावृत्ति जबकिआक्रमण luding, स्थापित मानव कोशिका लाइनों के Orthotopic xenografts आम तौर पर नहीं 21,23,25 करते हैं. साथ ही, सामान्य मानव astrocytes और एनएससी इन विट्रो में और vivo 13,14,26 में तारिकाकोशिकार्बुद tumorigenesis मॉडल को परिभाषित oncogenic परिवर्तन के साथ अनुवांशिक इंजीनियर किया गया है. इन कोशिकाओं को स्थापित मानव कोशिका लाइनों और PDX के जीनोमिक जटिलता की कमी है और इसे सही मानव तारिकाकोशिकार्बुद ऊतकविकृतिविज्ञानी पुनरावृत्ति, लेकिन विवो में immunodeficient कृन्तकों में xenografting की आवश्यकता है. सभी मानव कोशिका मॉडल प्रतिरक्षा की मध्यस्थता xenograft अस्वीकृति को रोकने के लिए immunodeficient कृंतक मेजबान की आवश्यकता होती है, क्योंकि इन मॉडलों स्ट्रोमा से लक्षित और प्रतिरक्षा modulatory के पूर्व नैदानिक जांच सीमित, एक syngeneic प्रणाली की देशी ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत पुनरावृत्ति करने में विफल और एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी 10,11 उपचारों.
Oncogenic Muta के पूर्व निर्धारित संयोजन के प्ररूपी परिणामों के मणि परमिट परीक्षासीटू tumorigenesis में दौरान vivo में माहौल. गैर सशर्त मणि विकास भर में सभी ऊतकों के भीतर म्यूटेशन जबकि, सशर्त मणि सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों 10,11,15,18 के उपयोग के माध्यम से विशेष प्रकार की कोशिकाओं को Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन सीमित द्वारा म्यूटेशन की लक्ष्यीकरण कि सक्षम oncogenic alleles floxed है. सशर्त तारिकाकोशिकार्बुद मणि एक अक्षुण्ण मस्तिष्क 11 के भीतर अलग प्रकार की कोशिकाओं में oncogenic परिवर्तन के कार्यात्मक भूमिका स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया गया है. सशर्त मणि का उपयोग सीटू gliomagenesis में की preclinical उपयोगिता 1) इन विट्रो सहसंबंधी की कमी, जटिल जीनोटाइप के साथ सीटू ट्यूमर के विकास में की, 3) लंबे विलंबता चूहों की बड़ी साथियों को पैदा करने में 2) कठिनाई सहित कारकों की एक संख्या से सीमित है 4) और स्टोकेस्टिक ट्यूमर प्रगति. बगल में tumorigenesis एक इसी में इन विट्रो मॉडल का अभाव है, क्योंकि इन विट्रो में औषधि परीक्षण डब्ल्यू नहीं किया जा सकताith पारंपरिक सशर्त मणि मॉडल. अन्य कैंसर के विपरीत, astrocytomas की सशर्त मणि मॉडल मुश्किल से ही एकल oncogenic म्यूटेशनों 11 द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. इस प्रकार, जटिल प्रजनन योजनाओं कई oncogenic परिवर्तन के साथ सशर्त मणि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं. उच्च ग्रेड astrocytomas को प्रगति आम तौर पर एक गैर वर्दी, स्टोकेस्टिक तरीके से होती है और अंत में जटिल जीनोमिक परिदृश्य और तेजी से विकास कैनेटीक्स 27 से ट्यूमर को जन्म देता है, जबकि इसके अलावा, तारिकाकोशिकार्बुद दीक्षा, इन मॉडलों में एक लंबे विलंबता अवधि के बाद चर penetrance के साथ होता है, 28. सशर्त मणि मॉडल में चर अंतर्वेधन और घातक प्रगति की स्टोकेस्टिक प्रकृति व्यक्तिगत चूहों preclinical दवा परीक्षणों में उनके नामांकन से पहले उच्च ग्रेड astrocytomas की उपस्थिति और स्थान का पता लगाने के लिए रेडियो ग्राफिक इमेजिंग द्वारा जांच की आवश्यकता है. साथ में ले ली, इन सीमाओं के जनसंपर्क के लिए आवश्यक पीढ़ी और सशर्त मणि की बड़ी साथियों के परीक्षण में बाधाeclinical औषधि परीक्षण.
विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार पर वायरल रिसेप्टर (TVA) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर मणि को संक्रमित करने एवियन रेट्रोवायरल (RCAs) वैक्टर का इस्तेमाल करता है जो RCAs-TVA मणि प्रणाली, बड़े पैमाने पर तारिकाकोशिकार्बुद tumorigenesis 11 मॉडल के लिए उपयोग किया गया है. सशर्त मणि के विपरीत, इस मॉडल प्रणाली जटिल प्रजनन योजनाओं के लिए आवश्यकता के बिना विशिष्ट कोशिकाओं प्रकार में कई oncogenic म्यूटेशन की शुरूआत के लिए सक्षम बनाता है. हालांकि, यह चर अंतर्वेधन, सक्रिय रूप से वायरल एकीकरण को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के विभाजन के लिए आवश्यकता है, और मेजबान जीनोम 29 में transgenes की यादृच्छिक प्रविष्टि के द्वारा सीमित है.
वे अन्य मॉडल प्रणाली 15 की सीमाओं के कई दूर क्योंकि रत्न से काटा कोशिकाओं का उपयोग जो गैर germline मणि (nGEM) मॉडल, तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं. तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन में सेल प्रकार और सह होने वाली म्यूटेशन की शुरुआत की भूमिका रोकते मुश्किल हो जाता हैवे घातक प्रगति के दौरान अपरिभाषित प्रकार की कोशिकाओं में व्यापक आनुवंशिक परिवर्तन जमा किया है कि अंतिम चरण के ट्यूमर से प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि मेरा मानव जीबीएम सेल लाइनों या PDX स्थापित का उपयोग कर. इसके विपरीत, astrocytomas की सभी ग्रेड विशिष्ट शुद्ध मस्तिष्क कोशिका प्रकार 11,30 के भीतर आनुवंशिक परिवर्तन परिभाषित उत्प्रेरण द्वारा nGEM का उपयोग कर मॉडलिंग की जा सकती है. इस प्रकार, विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन और सेलुलर और आणविक phenotypes पर सेल प्रकार का प्रभाव इन विट्रो में और vivo में निर्धारित किया जा सकता है. स्थापित मानव जीबीएम सेल लाइनों के लिए इसी प्रकार, nGEM का उपयोग प्रारंभिक इन विट्रो औषधि परीक्षण एक ही कोशिकाओं का उपयोग vivo में परीक्षण के लिए दवाओं को प्राथमिकता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विवो में tumorigenesis तो orthotopically प्रतिरक्षा सक्षम syngeneic littermates 30 के दिमाग में nGEM कोशिकाओं allografting द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. ये Orthotopic allograft मॉडल इसलिए न केवल पारंपरिक साइटोटॉक्सिक एक की विवो परीक्षण में अनुमतिएन डी उपचारों को निशाना बनाया, लेकिन प्रतिरक्षा modulatory और स्ट्रोमा-लक्षित चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह से. अंत में, ट्यूमर दीक्षा और प्रगति पर microenvironment की भूमिका में एक ही प्रकार की कोशिकाओं में एक ही म्यूटेशन का उपयोग nGEM और पारंपरिक मणि मॉडलों के बीच परिणामों की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
हम और दूसरों प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग तारिकाकोशिकार्बुद nGEM विकसित किया है – astrocytes, एनएससी, या oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPC) – मणि 30-34 से काटा. एक तारिकाकोशिकार्बुद nGEM के विकास के पीछे तर्क संभावित प्रतिरक्षा सक्षम जानवरों में इन विट्रो में पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण के लिए और इन विवो में इस्तेमाल किया जा सकता है कि विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणाम निर्धारित करने के लिए एक मॉडल तैयार करना था. Rb1 loxP / loxP, या TgGZT – हम व्यक्त phenotypically गुम्मट कॉर्टिकल astrocytes और गैर Cre से एनएससी, floxed आरबी मार्ग के साथ एक> 94% C57 / BL6 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा सशर्त मणि काटा121 – विभिन्न संयोजनों 35-39 में जीन – NF1 loxP / loxP, क्रास G12D, PTEN loxP / loxP – और RTK / रास / PI3K मार्ग floxed. हम Cre recombinase एन्कोडिंग adenoviral वैक्टर का उपयोग विट्रो में आनुवंशिक पुनर्संयोजन प्रेरित किया. कॉर्टिकल astrocyte फसल प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण होते हैं, इसलिए हम इन संस्कृतियों में GFAP + कॉर्टिकल astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए, ऐसे TgGZT मानव GFAP प्रमोटर से संचालित 121 के रूप में Ad5GFAPCre वैक्टर या प्रमुख oncogenic transgenes का उपयोग किया था. हम इन विट्रो में और vivo में cortical astrocytes और एनएससी में प्ररूपी जी 1 / एस के परिणामों (आरबी), MAPK, और PI3K मार्ग म्यूटेशन परिभाषित किया. MAPK और PI3K मार्ग सक्रिय G1 / एस दोषपूर्ण astrocytes molecularly मजाक उड़ाया मानव proneural जीबीएम और, Orthotopic इंजेक्शन पर, वर्दी विकास कैनेटीक्स, कम सुप्तावस्था साथ एक पूर्व निर्धारित स्थान में गठित ट्यूमर, और histopathologicमानव जीबीएम 30 के अल पहचान. Vivo में ट्यूमर के विकास के अनुदैर्ध्य निगरानी उपचार 40 के जवाब में उपचार साथियों और ट्यूमर के विकास की मात्रात्मक विश्लेषण को सामान्य बनाने के माध्यम से पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण एड्स. हम luciferase कॉर्टिकल astrocytes व्यक्त इंजेक्शन के साथ चूहों के अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग से ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स निर्धारित की. इसलिए, सशर्त रत्न से व्युत्पन्न cortical astrocytes और एनएससी तारिकाकोशिकार्बुद जुड़े म्यूटेशन के कार्य परिणामों और पूर्व नैदानिक दवा के विकास के लिए एक संभावित मॉडल प्रणाली की परिभाषा के लिए एक विनयशील मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण कदम, 2), 3) अच्छी तरह से कोशिकाओं को अलग कर देना, तानिका दूर करने के लिए महासंयोजिका नीचे ऊतक लेने के बिना प्रांतस्था आबकारी करने के लिए उचित फसल और cortical astrocytes की संस्कृति हैं 1) सुनिश्चित करने ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
Referências
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
- Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
- . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
- Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
- Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
- Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
- Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
- Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
- Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
- Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
- Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
- Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
- Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
- Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
- McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
- Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
- Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
- Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
- Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
- Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
- Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
- Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
- Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).
