モデル星細胞腫発症機序<em>体外</em>と<em>インビボ</em>皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
星細胞腫は最も一般的な原発性脳腫瘍と神経膠芽（GBM）は、グレードIV星状細胞腫は、12〜15ヶ月1,2の生存期間の中央値で、最も一般的で積極的なサブタイプである。びまん性星状細胞腫の浸潤、特にGBMは、アジュバント療法の有効性を制限し、必然的に、治療後の再発3につながり、完全な外科的切除を妨げる。デノボ（一次）GBMまたは必然的に（二次）GBM 4に進む低学年星細胞腫とのどちらか最初に存在する患者。 GBMはゲノム不均質であり、3つのコアのシグナル伝達経路を支配する遺伝子における相互に排他的と共起する突然変異により特徴付けられる：G 1 / S（Rbの）細胞周期チェックポイント、受容体チロシンキナーゼ（RTK）、およびTP53は 5-7の経路。 GBMは、GBMのサブタイプがインフルであることを示唆し、脳の異なる細胞型に似ている異なる発現プロファイルを有する4つのゲノムのサブタイプから構成され原点6,8,9、そのセルによって積んだ。より良い星状細胞腫モデルは星状細胞腫の病因の間に特定の細胞型における変異の特定の組み合わせの役割を定義するために必要とされる。より効率的な前臨床薬剤開発のためのこれらのモデルを活用することで、最終的には患者の転帰の改善に役立たせていただきます。現在の星状細胞腫モデルは、ヒト細胞株、患者由来の異種移植片（PDX）、遺伝的に改変された正常なヒト星状細胞および神経幹細胞（NSC）、及び遺伝子操作されたマウス（GEM）10-14を確立することを含む。皮質星状細胞およびNSC – -フロックス発癌性対立遺伝子のさまざまな組み合わせを宿すGEMから収穫当社は、主要な脳細胞を利用し、代替、非生殖系列GEM（nGEM）モデル15を開発しました。目標は、表現型がiの前臨床薬剤開発のためのインビトロおよびインビボの両方を特徴とする、潜在的に利用することができる遺伝的に定義された細胞と星状細胞腫モデルを生成することであったmmuneコンピテントマウス。
確立されたヒト細胞株は、彼らはまっすぐ進む、技術的に広く入手可能である。星細胞腫の病因とin vitroおよびin vivoでの薬物応答の中で最も一般的に使用されたモデルであり、免疫不全マウス10,11,16-18に同所異種移植時の動態および腫瘍形成性を定義している。その欠点は、高悪性度星状細胞腫の研究を制限し、低グレード星状細胞腫から確立された細胞株を生成することができないことが挙げられる。起源の定義されたセルの欠如;多くの場合、元の患者の試料から著しく異なるゲノムプロファイルとの複合体のゲノム異常の存在、;血清11,17,19-22シリアル培養中の表現型および遺伝子型のドリフトに対する感受性。確立されたヒトGBM細胞株における個別の発癌性変異の表現型の結果は、多くの場合、elucを排除し、実際に存在している異常の多数によってマスクすることができる直接遺伝子型 – 表現型の結果のidation。
PDXは、免疫不全マウス、または免疫不全マウス12,23の脳への同所注射前に定義され、無血清培地中で非付着性スフェロイドとしてのそれらの培養を通して患者絶縁星状細胞腫細胞の皮下通路を介して生成される。 PDXより正確にヒト星状細胞腫のゲノム景観を維持するが、確立されたヒト細胞株と同様に、個別の発癌性変異の表現型効果は、それらのゲノムの複雑19,24をマスクすることができる。特に新規治療法に応答して、特定の発癌性突然変異の表現型の結果を定義するために、確立されたヒト細胞株またはPDXのパネルは、しばしば、遺伝子型 – 表現型相関を確立する一般化を示し、細胞株特異的効果の可能性を最小化するために利用される。 PDXは正確に人間の星状細胞腫、株式会社の組織病理学的特徴を再現しながら侵略をluding、確立されたヒト細胞株の同所異種移植片は、一般的ではない21,23,25を行います。さらに、正常なヒト星状細胞およびNSC は、in vitroおよびin vivo 13,14,26 で星状細胞腫腫瘍形成をモデル化するために定義された発癌性変異を有する遺伝子操作されています。これらの細胞は、樹立されたヒト細胞株およびPDXのゲノム複雑性を欠いており、正確に人間の星状細胞腫組織病 理を再現するが、 生体内で免疫不全げっ歯類における異種移植を必要とする。すべてのヒト細胞モデルは免疫介在異種移植片拒絶を防止するために、免疫不全げっ歯類宿主を必要とするため、これらのモデルは間質を標的とする免疫調節性の前臨床研究を制限する、同系のシステムのネイティブ腫瘍 – 間質相互作用を再現するために失敗し、無傷の免疫系を欠いている治療法10,11。
発癌牟田所定の組み合わせの表現型の結果のGEM許可検査その場での腫瘍形成における中の生体内でのン。非条件GEM開発を通じて全ての組織内に変異を有するのに対し、条件付きGEMは、細胞型特異的プロモーター10,11,15,18の使用を介して特定の細胞型へのCre介在組換えを制限することにより、突然変異の標的化可能に発癌性対立遺伝子をフロックスいる。条件付き星細胞腫GEMは、無傷の脳11内の異なる細胞型において発癌性変異の機能的役割を解明するために利用されてきた。条件付きGEMを用いたin situハイ gliomagenesis での前臨床有用性は、1）in vitroでの相関の欠如は、複雑な遺伝子型インサイチュ腫瘍発生での、3）長い待ち時間をマウスの大集団を生成する2）難しさを含むいくつかの要因によって制限され、4）、確率的腫瘍進行。 その場で腫瘍形成は、対応するin vitroモデルがないため、in vitroでの薬物検査は、ワットを行うことができないi番目の従来の条件付きのGEMモデル。他の癌とは対照的に、星状細胞腫の条件付きGEMモデルはめったに単一の発癌性の変異11によって誘導されていません。したがって、複雑な育種スキームは、複数の発癌性変異を有する条件付きGEMを生成するのに必要とされる。ハイグレード星状細胞腫への進行は、一般的に不均一な、確率論的な方法で行われ、最終的には、複雑なゲノム風景や急速な成長速度27を有する腫瘍を引き起こすながらさらに、星状細胞腫開始は、これらのモデルにおける長い潜伏期間の後に変数浸透率で発生し、 28。可変浸透度と条件GEMモデルにおける悪性進行の確率的性質は、個別のマウスは前臨床薬物試験におけるそれらの入学前にハイグレード星状細胞腫の存在および位置を検出するために、放射線画像撮影によりスクリーニングされている必要があります。まとめると、これらの制限は、広報に必要な発生および条件GEMの大コホートの試験を妨げるeclinical薬物検査。
特定の神経細胞タイプで、ウイルス受容体（TVA）を発現するように操作GEMを感染させるために、鳥類レトロウイルス（RCAS）ベクターを利用したRCAS-TVAのGEMシステムは、広範囲に星状細胞腫腫瘍形成11をモデル化するために利用されてきた。条件GEMとは対照的に、このモデル系は、複雑な育種スキームを必要とすることなく、特定の細胞型における複数の発癌性突然変異の導入を可能にする。しかし、宿主ゲノム29に可変浸透度、積極的にウイルス組込みを達成するためにセルを分割するための要件、および導入遺伝子のランダム挿入によって制限される。
彼らは他のモデルシステム15の制限の多くを克服するために、GEMから採取した細胞を利用することが非生殖系列GEM（nGEM）モデルは、ますます重要になってきている。星状細胞腫の病因に細胞型と共に生じる突然変異を開始する役割を抑止することが困難であるそれらは悪性進行の過程で未定義の細胞型において広範な遺伝子突然変異を蓄積して最終段階の腫瘍に由来しているので、鉱山は、ヒトGBM細胞株またはPDXを確立用い。対照的に、星状細胞腫のすべてのグレードは、特定の精製された脳細胞型11,30内に定義され、遺伝的突然変異を誘発することによってnGEMを使用してモデル化することができる。したがって、特定の遺伝子変異および細胞および分子の表現型上の細胞型の影響は、in vitroおよびin vivoで決定することができる。確立されたヒトGBM細胞株と同様に、nGEMを使用して初期のin vitro薬物試験は、同じ細胞を用いたin vivo試験薬を優先順位付けするために使用することができる。 in vivoでの腫瘍形成は、その後、免疫能のある同系同腹仔30の脳に同所nGEM細胞を同種移植することによって決定することができる。これらの同所同種移植モデルはそのためだけでなく、従来の細胞毒性aのin vivo試験を許可ND治療を目標とするが、免疫調節および間質標的療法にも。最後に、腫瘍の開始と進行に対する微小環境の役割は、同じ細胞型において同じ突然変異を用いてnGEM、従来のGEMモデル間の結果を比較することによって決定することができる。
星状細胞、NSC、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC） – – GEM 30-34から採取たちなどが初代細胞を使用して星状細胞腫nGEMを開発した。星状細胞腫nGEMの開発の背後にある理論的根拠は、潜在的に免疫コンピテント動物においてin vitroでの前臨床薬物試験およびインビボで使用することができる特定の細胞型における発癌性変異の表現型の結果を決定するためのモデルを作成することであった。 Rb1の型loxP / loxP配列 、またはTgGZT -私たちは、表現、表現型、WT皮質星状細胞および非CreをからNSC、フロックスRB経路で> 94％C57BL / 6バックグラウンド上で維持条件付きGEMを収穫121 -とRTK / RAS / PI3K経路フロックス- NF1 のloxP / loxP配列 、KrasのG12D、のPten のloxP / loxP配列 -さまざまな組み合わせの遺伝子35-39を 。私たちは、Creリコンビナーゼをコードするアデノウイルスベクターを用いてインビトロで遺伝子組換えを誘導した。皮質アストロサイトの収穫は、細胞型の混合物が含まれているため、当社はこれらの培養におけるGFAP +アストロサイト皮質を濃縮するために、Ad5GFAPCreベクターまたはヒトGFAPプロモーターから駆動されるようTgGZT 121のような支配的な発癌性遺伝子を、使用しました。私たちは、MAPKおよびPI3K経路突然変異は、インビトロおよびインビボでの皮質星状細胞およびNSCにおいて、G 1 / S（RB）の表現型の結果を定義した。 MAPKおよびPI3K経路活性化、G1 / S-欠陥のあるアストロサイトに分子模倣人間の前神経のGBMと、同所注射の際、均一な成長速度、短いレイテンシで事前に定義された場所に形成された腫瘍および組織病理学的人間GBM 30のアル顕著な特徴。 インビボでの腫瘍増殖の長手モニタリングは、治療コホートの正規化および処置40に応答した腫瘍増殖の定量分析を介して前臨床薬物試験を助ける。私たちは、皮質星状細胞を発現するルシフェラーゼを注射したマウスの長手方向の生物発光イメージングによる腫瘍増殖速度を決定した。そのため、条件付きのGEMから派生皮質星状細胞およびNSCは、星状細胞腫関連変異の機能的な結果および前臨床薬剤開発のための潜在的なモデルシステムの定義のための扱いやすいモデル系を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
最も重要なステップは、2）、3）徹底的に細胞を解離するために、髄膜を除去して、脳梁の下に組織を取らずに皮質を切除するための適切な収穫と皮質アストロサイトの文化である1）を確保するため、4）、GFAPを濃縮するために+アストロサイト。私たちは（GFAPプロモーターの制御下Ad5GFAPCreベクターまたはドミナント転換、導入遺伝子の利用と遺伝子組換えの制約（TgGZT …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
Referências
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