Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Summary

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

Abstract

Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado e exemplos de pesquisas que têm sido realizados utilizando FIONA são descritas resumidamente. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Em seguida, como para realizar uma experiência simples fIONA em localizar moléculas imobilizadas com Cy3 de ADN individuais utilizando os protocolos apropriados, seguindo-se a utilização de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot, é ilustrado. Por fim, o esforço recente para estender a aplicação da FIONA para amostras espessas é relatado. Mostra-se que, utilizando uma objectiva de imersão em água e pontos quânticos embebido profundamente em sol-gel e córneas do olho de coelho (>200 mm), a precisão da localização 2-3 nm pode ser atingida.

Introduction

Por volta de 1882, Ernst Abbe descobriu que a resolução de um microscópio de luz visível é ~ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (onde λ é o comprimento de onda e NA é a abertura numérica) ^1,2. Por conseguinte, qualquer objecto mais pequeno do que esta dimensão que aparecem como uma mancha de difracção limitada, no microscópio óptico. No entanto, é possível determinar o centro do ponto, isto é, a localização do objecto, com uma precisão muito superior ^3. Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy ^4. A precisão da locali....

Protocol

Declaração de Ética: O tecido da córnea de coelhos foi coletado de acordo com a Universidade de Illinois Institutional Animal Care e Uso diretrizes.

Configuração 1 TIRFM

NOTA: Utilizar óculos de laser de segurança o tempo todo.

1. Certifique-se de que todos os componentes ópticos necessários listados na Lista de Materiais estão disponíveis e prontos para o alinhamento. Se necessário, usar substitutos com funções equivalentes de outras empresas. Certifique-se de que os espelhos e lentes devem ter (AR) revestimentos anti-reflexo que correspondem o laser em uso.
2. Definir as alturas de todos os el....

Results

A configuração típica TIRFM tipo objetivo é mostrado na Figura 3. Primeiro, amostra Cy3-DNA imobilizado na superfície foi fotografada. Uma imagem típica é mostrada na Figura 4a. A imagem foi feita com tempo de exposição de 0,5 seg, com ganho EM = 50 e sensibilidade CCD = 12,13 para a câmera. A função de espalhamento-ponto (PSF) de uma única molécula de DNA com Cy3 é mostrado na Figura 4b (a partir do local indicado pela seta da Figura 4-A), onde a barra.......

Discussion

Fiona é uma técnica para localizar a posição de um emissor fluorescente (fluoróforo orgânico ou quantum dot) com precisão nanométrica e resolução temporal de até 1 ms ^{4 a 8.} Quando os fótons suficientes são coletados, esta técnica permite determinar a posição de um emissor fluorescente com muito mais precisão do que o limite de difração (~ 200 nm) e, portanto, esta técnica abre uma maneira de observar o que não tem sido visto com microscopia óptica convencional / tradicional ^{4 - 8.} Desde sua invenç.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fita dupla face	3M		~75 µ câmera EMCCD de m de espessura
	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Limpador ultrassônico	Branson	2510
Conjunto de filtros de fluorescência	Chroma	49016
Tampão de polimerização de actina	Citoesqueleto	BSA02
Biotina G-actina	Citoesqueleto	AB07
G-actina	Citoesqueleto	AKL95
Tampão de actina geral	Citoesqueleto	BSA01
(com driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Lamínula	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm de espessura
Lâmina	de microscópio Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm de espessura
Limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC-001
Prato de fundo de vidro	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies		5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-estreptavidina	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Kit de Conjugação de Anticorpo	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
Mesa óptica	Newport Corp		RS4000 Series
60X Objetiva	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objetiva	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Objetiva de Óleo ∞/0.17
60X Objetiva	Microscópio invertido Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab
Anti-FLAG anticorpo	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotina	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatina Fosfoquinase do músculo de coelho
CP	Sigma Aldrich	P1937	Fosfocreatina di (tris) sal
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ′, N ′ ácido -tetracético
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Ácido protocatecuico
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatecuato-3,4-dioxigenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetrametil ortosilicato
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxilico ácido
1" de diâmetro dielétrico espelhos dielétricos de banda larga com montagens	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantidade: 2
½ ” postes de diâmetro	Thorlabs	TR4	Quantidade ≥ 6
expansores de feixe 10X	Thorlabs	BE10M-A
Lente de 2" de diâmetro f = 300 mm com montagem	Thorlabs	LA1256-A, lente TIR LMR2
Alvo de alinhamento fluorescente	Thorlabs
Óculos de segurança a laser	Thorlabs	) LG3
ND	Thorlabs	FW1AND
	Thorlabs	BP209-VIS
Diafragma de íris pós-montado	Thorlabs	ID25	Quantidade: 2
Interferômetros de cisalhamento	Thorlabs	SI100
XYZ, ½ ” viagem	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW