Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Summary

Vários biomarcadores patológicos não podem ser facilmente detectados pelas técnicas atuais devido à sua baixa concentração em fluidos biológicos, à presença de enzimas degradantes e a grandes quantidades de proteínas de alto peso molecular. Nanopartículas de hidrogel quimicamente funcionalizadas podem colher, preservar e concentrar proteínas de baixa abundância, permitindo a detecção de biomarcadores anteriormente indetectáveis.

Abstract

Descoberta de biomarcadores Novel desempenha um papel crucial no fornecimento de detecção mais sensível e específico para a doença. Infelizmente muitos biomarcadores baixa abundância que existem em fluidos biológicos não pode ser facilmente detectada com a espectrometria de massa ou imunoensaios, pois eles estão presentes em concentrações muito baixas, são instáveis, e muitas vezes são mascarados por proteínas de abundância elevada, tais como albumina ou imunoglobulina. Bait contendo poli (N-isopropilacrilamida) (NiPAM) nanopartículas à base são capazes de superar essas barreiras fisiológicas. Num passo que eles são capazes de captar, concentrar e preservar biomarcadores de fluidos corporais. Analitos de baixo peso molecular entrar no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, os quais actuam como iscos de proteína com elevada afinidade. As nanopartículas são capazes de se concentrar as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. Este factor de concentração é suficiente para aumentar o nível de proteína de tal modo que as proteínas estão dentro dolimite de detecção de corrente de espectrómetros de massa, transferência de western, e imunoensaios. As nanopartículas podem ser incubadas com uma variedade de fluidos biológicos e que são capazes de enriquecer grandemente a concentração de proteínas de baixo peso molecular e de péptidos e excluindo albumina e outras proteínas de alto peso molecular. Os nossos dados mostram que uma amplificação de 10.000 vezes na concentração de um analito particular, pode ser conseguido, permitindo que a espectrometria de massa e ensaios imunológicos para detectar biomarcadores anteriormente indetectáveis.

Introduction

Apesar da conclusão do seqüenciamento do genoma humano, um progresso significativo não foi alcançado na identificação de biomarcadores preditivos de doença em estágio inicial, ou que se correlacionam com os resultados terapêuticos, ou prognóstico ^1. Uma das razões para esta falta de progresso é que muitos biomarcadores potencialmente significativas existem em uma concentração abaixo do limite de detecção de espectrometria de massa convencional e outras plataformas de descoberta de biomarcadores. Espectrometria de massa (MS) e monitorização de reacções múltiplas (MRM) tem uma sensibilidade de detecção, tipicamente maior do que 50 ng / ml, enquanto a maioria....

Protocol

O plasma humano e urina foi coletada a partir de doadores voluntários saudáveis, com consentimento informado por escrito, seguindo de Revisão Institucional da Universidade George Mason Conselho aprovou protocolos. Os doadores foram distribuídos igualmente entre homens brancos e mulheres entre as idades de 25 e 42 amostras foram analisadas individualmente e não foram reunidas.

1. nanopartículas de Processamento de amostras de soro ou plasma

Baixas biomarcadores potenciais abundante no plasma são capturados, em solução, com nanopartículas de hidrogel. As partículas são adicionadas ao plasma, incubadas, separadas p....

Results

Hidrogel nanopartículas tamanho e uniformidade

Poli (NiPAM-AAC) partículas foram produzidas com um rendimento extremamente elevado e reprodutibilidade entre e dentro dos grupos. As partículas têm muito boa estabilidade coloidal à TA durante o tempo necessário para a recolha, o armazenamento, e a eluição das proteínas (pelo menos 48 horas), e precipitação das nanopartículas não foi observado (Figura 1) ^11. A estabilidade coloidal pode ser muito imp.......

Discussion

Relevância Clínica

Uma amostra de soro ou plasma é pensado para conter baixa abundância de proteínas e peptídeos que podem proporcionar uma fonte rica de informações sobre o estado do organismo como um todo em circulação. Apesar da promessa de proteômica de soro, há três barreiras fisiológicas fundamentais e graves dificultando a descoberta de biomarcadores e tradução para o benefício clínico ^{10, 11, 16, 25.}

1. biomarcadores de diagnós.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanopartículas de hidrogel	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP partículas
18 MΩ-cm água			Tipo 1 água de grau reagente
Tris HCl, 50 mM pH 7,0	VWR	IC816116	50 mM, pH 7
Acetonitrila	BDH	BDH1103-4LP	Disponível na VWR
Hidróxido de amónio NH4OH	BDH	BDH3014	Disponível na VWR, testado a 28-30% NH3
Tiocianato de sódio 25	mM Acros Organics	419675000	Para amostras de soro/plasma
Tiras de reagentes de urina multi-analitos	Siemens	2161	Para amostras de urina
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	Use em RT para evitar que SDS precipite
Incubadora de banho seco (100 oC) com bloco de aquecimento	Barnstead	11-715-125DQ	Não substitua um banho-maria fervente
Coletor do evaporador de nitrogênio	Organomation Associates	Microvap118	Para amostras de soro/plasma
Centrífuga, rotor basculante	Série Sorvall	Legend Capacidade	do tubo de 50 ml, rcf 3.700 x g
Centrífuga, rotor de ângulo fixo	Eppendorf	5424	Capacidade de microcentrífuga de 1,7 ml, RCF 16.000 x G
Centrífuga cônica de 50 ml  tubos	Fisher Scientific	14-432-22	Com tampas de rosca para amostras de urina
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Eppendorf	22363204
Misturador Vortex	Fisher Scientific	50-949-755
Temporizador	Fisher Scientific	S04782	Segundos/minutos