Hydrogel Nanopartikel Høst af plasma eller urin til påvisning af lav tæthed Proteiner

Summary

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Abstract

Roman biomarkør opdagelse spiller en afgørende rolle i at yde mere følsom og specifik påvisning sygdom. Desværre er mange med lav hyppighed biomarkører, der findes i biologiske væsker kan ikke let afsløres med massespektrometri eller immunassays, fordi de er til stede i meget lav koncentration, er labil, og er ofte maskeret af høj overflod proteiner, såsom albumin eller immunglobulin. Bait indeholdende poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAM) baseret nanopartikler er i stand til at overvinde disse fysiologiske barrierer. I et skridt, de er i stand til at indfange, koncentrere sig og bevare biomarkører fra kropsvæsker. Lavmolekylære analytter indtaste kernen af ​​nanopartikel og opfanges af forskellige organiske kemiske farvestoffer, der fungerer som høj affinitetsprotein lokkemad. De nanopartikler er i stand til at koncentrere proteiner af interesse ved flere størrelsesordener. Denne koncentration faktor er tilstrækkelig til at forøge protein-niveau, således at proteinerne er inden fordetektionsgrænse nuværende massespektrometre, Western blotting og immunoassays. Nanopartikler kan inkuberes med et væld af biologiske væsker, og de er i stand til i høj grad berige koncentrationen af ​​lavmolekylære proteiner og peptider med udelukkelse af albumin og andre højmolekylære proteiner. Vore data viser, at en 10.000 gange amplifikation i koncentrationen af ​​en bestemt analyt kan opnås, så massespektrometri og immunassays til påvisning af hidtil upåviselige biomarkører.

Introduction

På trods af gennemførelsen af det menneskelige genom sekventering, er ikke blevet gjort betydelige fremskridt med at indkredse biomarkører prædiktive af sygdommens tidlige stadium, eller at korrelere med terapeutisk udfald, eller prognose ^1. En af grundene til denne mangel på fremskridt er, at mange potentielt vigtige biomarkører findes i en koncentration under grænsen for konventionelle massespektrometri og andre biomarkører platforme afsløring. Massespektrometri (MS) og Multiple Reaction overvågning (MRM) har en følsomhed typisk større end 50 ng / ml, mens størstedelen af ​​de analytter måles ved immunoassays i et klinisk laboratorium fald i området mellem 50 pg / ml og 10 ng / ml . Det betyder, at mange biomarkører, især i den tidlige fase af en sygdom, der ikke kan påvises ved konventionel MS og MRM ^2. Desuden tilstedeværelsen af ​​høj overflod proteiner, såsom albumin og immunoglobulin i komplekse biologiske væsker ofte maske med milliard-fold excess lav forekomst, lavmolekylære proteiner og peptider ^{3, 4.} Af denne grund er påkrævet med flere prøver forberedende skridt forud for massespektrometri sekventering og identifikation. En sådan forberedende skridt beskæftiger udtømning af høj overflod proteiner med kommercielt tilgængelige udtynding kolonner ^5-8. Desværre er dette trin fører til reduktion af udbyttet af kandidat biomarkører fordi de ofte er ikke-covalent forbundet med bærerproteiner, der bliver fjernet. En anden udfordring er repræsenteret ved stabiliteten af kandidat biomarkører ex vivo, når prøverne er indsamlet. Proteiner er udsat for nedbrydning af endogene eller exogene proteaser ^9. Hydrogel nanopartikler kan transcendere disse kritiske udfordringer ved at forstærke den formodede biomarkør koncentrationen til et niveau inden for området af analysen samtidig beskytte proteinet mod nedbrydning ^10-13.

Det er vigtigt at bemærke, thpå LMW proteiner i blodet er en blanding af små intakte proteiner samt fragmenter af store proteiner. Væv-afledte proteiner er større end 60 kDa, er for store til passivt ind i blodet gennem det vaskulære basalmembran, men de kan være repræsenteret i blod som peptider eller proteinfragmenter ^14. Vores mål er at måle nye cirkulerende biomarkører, der kan være kandidater til tidlig påvisning af sygdom, patient lagdeling til terapi, og monitorering af respons på behandlingen. Vores nanopartikler er skabt til selektivt at udelukke høj overflod immunoglobuliner og albumin, samtidig med at opfange små proteiner og peptider og koncentrere dem op til 100 gange afhængig af volumen start.

Vores gruppe identificeret et sæt af små organiske farvestoffer, der med succes kan virke som høj affinitet molekylære lokkemad for proteiner og peptider. Protein-dye binding menes at skyldes en kombination af hydrofob og elektrostatisk interaktionsek. De aromatiske ringe på farvestoffet interleave med proteiner via hydrofobe lommer på proteinet overflade ^11.

Lokkemaden, afhængig af deres kemi, udviser en særlig affinitet for udvalgte klasser af analytter. Lokkemaden konkurrere med bærerproteiner, såsom albumin, for proteiner eller peptider. De lavmolekylære proteiner / peptider blive fanget i partiklen. Højmolekylære proteiner, såsom albumin og immunoglobulin forhindres partiklen grund af sigtning kapacitet på grund af den restriktive pore i hydrogelen ¹¹ (figur 1).

Hydrogel nanopartikler syntetiseres ved udfældning polymerisation initieret af ammoniumpersulfat ^11. N-isopropylacrylamid (NIPAM) er co-monomerer af acrylsyre (AAC) og allylamin (AA) og tværbindingsmiddel N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) lov at reagere ved 70 ° C i 6 timer i fortyndede betingelser ¹1, 13. Den høje proteinbinding affinitet af poly (N isopropylacrylamid-co-acrylsyre) (poly (NIPAM-CO-AAC) nanoparticlesis opnås ved kovalent at inkorporere aminoholdige farvestoffer (dvs.., Sulfonatedanthraquinonetriazine farvestoffer) i nanopartikler gennem en amideringsreaktion udføres i vandige eller organiske opløsningsmidler, afhængigt af hydrofile / hydrofobe egenskaber for farvestofferne ^{11, 13.} nukleofil substitution af amingrupperne i nanopartikel med chlorid atom af en anthraquinonetriazine farvestof udnyttes til at skabe farvestof-holdige poly (NIPAM co-Allylamin) (AA) nanopartikler ^{11, 12.} En to-trins polymerisation proces udnyttes til at skabe hydrogel nanopartikler indeholdende et yderstof af vinylsulfonsyre (VSA) ^{11 13.}

Hydrogel nanopartikler kan anvendes til forskellige biologiske væsker, herunder fuldblod, plasma, serum, cerebrospinalvæske, sved og urin. I et skridt, i opløsning, nanoparticles udføre en hurtig (inden for minutter) beslaglæggelse og koncentration af lavmolekylære analytter ^{10, 11, 13, 15-18.} Proteiner elueres derefter fra nanopartikler og detekteres under anvendelse af western blotting ^19-21, massespektrometri ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23,} immunassays / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​eller omvendt fase-protein microarray ^{16 24} assays. Nanopartikler funktionaliseret med kemisk agn, og præsentere en kerne eller kerne shell arkitektur, opsamling og koncentrere proteiner baseret på agn / shell fysisk-kemiske egenskaber. Forskellige farvestoffer inkorporeres i nanopartiklerne vil derfor fange forskellige undersæt af proteiner med varierende effektivitet baseret på farvestoffet affinitet, pH af opløsningen, og tilstedeværelse / fravær af konkurrerende høje rigelige proteiner ^13. Endvidere vil mængden af ​​nanopartikler i forhold til mængden af ​​opløsningen påvirker proteinudbytte fra nanopartikler. Disse aspekter afhydrogel nanopartikel høst er påvist ved hjælp af tre forskellige nanopartikler lokkemidler til høst proteiner fra plasma prøver, der indeholder store mængder af protein og fra urinprøver, som typisk ikke indeholder store mængder protein. I denne protokol vi demonstrere høst og koncentrere tumornekrosefaktor-alpha (TNFa) fra plasmaprøver under anvendelse af poly (NIPAM-co-AAC), poly (NIPAM / farvestof) og kerne- shell nanopartikler (poly (NIPAM-co-VSA)) . Poly (NIPAM / farvestof) nanopartikler er vist til at koncentrere Mycobacterium arter antigen, der blev føjet til humane urinprøver, at efterligne Mycobacterium tuberculosis inficerede individer.

Protocol

Humant plasma og urin blev opsamlet fra raske frivillige donorer, med skriftligt informeret samtykke, efter George Mason University Institutional Review Board godkendte protokoller. Donorerne blev ligeligt fordelt mellem hvide mænd og kvinder i alderen mellem 25 og 42. Prøver blev analyseret enkeltvis og blev ikke medtaget. 1. Nanopartikel Forarbejdning af serum eller plasma prøver Potentielle lave rigelige biomarkører i plasma fanget i opløsning med hydrogel …

Representative Results

Hydrogel Nanopartikel Størrelse og Ensartethed Poly (NIPAM-AAC) partikler er blevet fremstillet med ekstremt højt udbytte og reproducerbarhed mellem og inden partier. Partiklerne har meget god kolloid stabilitet ved RT i løbet af den tid, der kræves for registrering, lagring, og eluering af proteiner (mindst 48 timer), og nanopartikel nedbør er ikke blevet observeret (figur 1) 11. Den kolloide stabilitet kan være meget vigtigt for hurtig pro…

Discussion

Klinisk relevans

En serum eller plasma prøve menes at indeholde lav overflod cirkulerende proteiner og peptider, som kan give en rig kilde til information om tilstanden af ​​organismen som helhed. Trods løftet om serum proteomics, er der tre grundlæggende og alvorlige fysiologiske barrierer modarbejde biomarkør opdagelse og oversættelse til klinisk fordel ^{10, 11, 16, 25.}

1. Vigtige diagnostiske biomarkører kan eksistere i eks…

Materials

hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes