Dissektion og immunfarvning af fantasiens diske fra<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

En væsentlig del af post-fosterudvikling hos bananfluen, Drosophila melanogaster, finder sted inden for et sæt af SAC-lignende strukturer, der kaldes fantasiens diske. Disse diske giver anledning til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flue. Her beskriver vi en protokol, der er optimeret til at inddrive disse diske og forberede dem til analyse med antistoffer, transkriptionale reportere og protein fælder. Denne procedure er bedst egnet til tynde væv som imaginal discs, men kan let modificeres til anvendelse med tykkere væv, såsom larve hjerne og voksen æggestok. Den skriftlige protokol og tilhørende video vil guide læseren / seeren gennem dissektion af tredje stadie larver, fiksering af væv, og behandling af fantasiens diske med antistoffer. Protokollen kan bruges til at dissekere imaginære diske fra yngre første og andet stadium larver samt. Fordelen ved dette er, at den er forholdsvis kort, og det har væreOr optimeret til høje konservering af det dissekerede væv kvalitet. En anden fordel er, at fiksering procedure, der anvendes fungerer godt med det overvældende antal af antistoffer, der genkender Drosophila-proteiner. Det er vores erfaring, at der er et meget lille antal følsomme antistoffer, der ikke fungerer godt med denne procedure. I disse situationer synes middel til at være at bruge en alternativ fiksering cocktail samtidig med at følge de retningslinjer, som vi har angivet for dissektion trin og antistofinkubationer.

Introduction

For mere end et århundrede bananfluen, Drosophila melanogaster, har været en førende system til at studere udvikling, adfærd og fysiologi. Udvikling i fluen kan inddeles i to brede faser: embryonale og post-embryonale med meget af den sidstnævnte finder sted i monolag epiteler kaldet fantasiens diske ^1-3. Tegninger af fantasiens diske blev først udgivet i 1864 af August Weismann som en del af hans brede monografi om insekt udvikling ^1. Disse diske begynder deres udvikling under embryogenese, er mønstret i de larvestadier, overleve den massive histolysis af de tidlige puppe stadier, og i sidste ende føre til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flyve ^1-14. Under larveudvikling hver disk gør flere kritiske beslutninger om skæbne, form og størrelse. Inden for de første og anden larvernes instars er skiverne opgave at vedtage en primær skæbne, establishing Rumopdelinger vedtagelse den rigtige form og skabe det nødvendige antal celler ^15-16. I løbet af tredje larve stadie og tidlig præ-puppestadiet, fantasiens diske fortsat at dele og mønstrede som celler vedtager deres terminale skæbner ^16.

Under den tidlige historie Drosophila udviklingsmæssige biologi blev fantasiens diske studeret næsten udelukkende i forbindelse med en normal udvikling og i de begrænsede tilfælde, hvor et tab eller gevinst af funktion mutanten var levedygtig. Brugen af ​​røntgenstråler til at inducere mitotisk rekombination tilladt for letale mutationer, der skal analyseres i cellekloner i larvestadiet og voksne væv. Denne metode er blevet forbedret ved indførelse af transgene metoder til at analysere tab og få af funktion-mutationer i både larvernes og voksne væv. Antallet af antistoffer, transkriptionale reportere og proteinholdigt lokkemiddel til at beskrive den molekylære landskab af vildtype og mutant væv er også constgelige vokser. Ved hjælp af disse molekylære markører til at analysere tab og få af funktion mutant cellekloner har gjort det stadig muligt at opnå en real-time forståelse af, hvordan mutantceller afvige fra deres vildtype fætre under udviklingen. Til korrekt at drage fordel af disse værktøjer og reagenser er det afgørende at have præparater af fantasiens diske, der kan ses, fotograferet og analyseret af høj kvalitet. Målet med dette manuskript er at give en optimeret protokol til isolering og forberedelse af øje-antennal disk-kompleks (figur 1A). Det kan også med held anvendes til at isolere en lang række yderligere diske, herunder dem, der giver anledning til vinger, halteres, T1-T3 ben og kønsorganerne (Figur 1B-E). Denne procedure, med mindre modifikationer, er blevet anvendt til at isolere imaginære diske fra Drosophila i næsten 80 år.

Som beskrevet ovenfor, eftersom de fleste gener udtrykkes i multiple udviklingsstadier og i et væld af væv, er det ofte umuligt at undersøge de virkninger, som nulmutanter har på hele øjet som dyret dør længe før tredje stadie larvestadiet. Fire metoder har gjort undersøgelse af mere udviklede væv, såsom nethinden betydeligt mere medgørlige. Den første er Flippase (FLP) / Flippase rekombination Target (FRT) fremgangsmåde til generering af mutante cellekloner i en ellers vildtype væv ^17-19. I dette tilfælde mutant væv identificeres ved fraværet af en visuel markør, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og kan sammenlignes med det omgivende vildtype væv, hvori GFP er til stede (figur 2D). Den anden er "FLP-out" metode, hvor et transgen udtrykkes i en population af celler ^20. I dette tilfælde de cellekloner identificeret ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er den mosaiske Analyse med en repressibel cellemarkør (MARCM) teknik, der kombinerer elementer af FLP / FRT mutant klon og FLP-out ekspressionssystemer ^21. Med denne metode et transgen kan udtrykkes i en population af celler, som samtidig er mutant for et enkelt genetisk locus. Ligesom FLP-ud kloner er MARCM kloner identificeres ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP markør (figur 2F). Og endelig kan de gener og RNAi konstruktioner udtrykkes indenfor fantasiens væv under kontrol af specifikke promotor-GAL4 konstruktioner. Disse fire metoder har øget interessen for at studere fantasiens diske siden mutant eller overekspression kloner eller mønstre kan direkte sammenlignes med tilstødende vildtype væv. Beskrevet i denne procedure metode er udviklet således, at forskere, der studerer den post-embryonale udvikling af voksent væv i Drosophila,især dem, der stammer fra øjet-antennal disk, vil være i stand til at opnå væv af høj kvalitet til analyse. Selv om de enkelte forskere har lavet mindre ændringer, er kernen i denne procedure (som vi beskriver her) forblev stort set uændret. Da opnåelse af væv af høj kvalitet er afgørende for studiet af fantasiens diske vi håber denne skriftlige protokol og tilhørende video vil fungere som en værdifuld ressource i undervisningen.

Protocol

1. Fremstilling af Larver Fyld en 35 mm petriskål med dissektion buffer. Placer larver i petriskål og give dem mulighed for at svømme rundt i et par minutter (selvrensende trin). Overførsel larver til en pulje af dissektion buffer på et silikonebaseret dissektion plade. Denne pulje bør være ved en kant af pladen. Dissektion plade består af en silikone løsning, der er hældt og hærdet i et glas petriskål. Ved hjælp af en Pasteur-pipette, placere en større pulje af dis…

Representative Results

Den metode, der er beskrevet ovenfor, pålideligt producerer materiale af høj kvalitet til analyse med in situ-prober, transkriptionale reportere, protein fælder og antistoffer. I figur 1 viser vi øje-antenne, kønsorganer, fløj, haltere og ben diske, der er rutinemæssigt inddrives med denne metode. Disse skiver har været behandlet med et phalloidin-konjugeret fluorofor, som binder til F-actin, og derfor beskriver hver celle. Hvis vævet er blevet ordentligt fast derefter morfogenetiske f…

Discussion

Selv om denne fremgangsmåde i høj grad har fokuseret på isolation og efterfølgende behandling af øjet-antennal diske, er det muligt at foretage en bruges til at isolere og analysere fløj, haltere, ben og genitale diske (Figur 4). Den eneste nødvendige ændring af protokollen for at isolere disse diske (i modsætning til den øje-antennal disk) er metoden for grov dissektion (afsnit 2 i protokollen). Den første thorax ben (T1) par er fundet ved den forreste af larve og kan udvindes ved at følge …

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples