The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
ショウジョウバエにおけるポスト胚発生のかなりの部分、 キイロショウジョウバエは 、成虫と呼ばれる袋状構造のセット内で行われます。これらのディスクは、大人のハエ内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせる。ここでは、これらのディスクを回復し、抗体、転写レポーターとタンパク質トラップを用いた分析のためにそれらを準備するために最適化されたプロトコルを記述します。この手順では、成虫のような薄い組織に最も適しているが、簡単にそのような幼虫の脳と大人の卵巣厚い組織に使用するために修正することができます。書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは3齢幼虫、組織の固定、および抗体と成虫の治療の切開を介してリーダ/ビューアをご案内いたします。プロトコルは、同様に若い第一及び第二齢幼虫から成虫を分析するために使用することができます。このプロトコルの利点は、比較的短く、それがいることである解剖した組織の高品質保持のために最適化が備わっています。別の利点は、使用される固定手順ショウジョウバエタンパク質を認識する抗体の圧倒的な数でうまく動作することである。われわれの経験では、この手順ではうまく機能しない敏感な抗体の非常に小さな数があります。このような状況では、救済策は、私たちが解剖工程および抗体インキュベーションのために記載されているガイドラインに従うことを継続しながら、代替の固定カクテルを使用することであるように思われる。
一世紀以上ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエの場合は、開発、行動や生理機能を研究するための最高のシステムとなっている。成虫1-3と呼ばれる単層の上皮内後者の撮影場所の多くで胚および後胚:ハエにおける開発は、二つの大きな段階に分けることができる。 成虫の図面は最初の昆虫開発1の彼の広範な研究論文の一部として8月ワイスマンによって1864年に出版された。これらのディスクは、1〜14のフライ 、大人内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせ、最終的には初期の蛹の段階の大規模な組織分解を生き残る、と、幼虫の段階でパターニングして、胚形成の間彼らの開発を開始。幼虫の開発中に各ディスクには運命、形状やサイズに関するいくつかの重要な決定を行う。第一及び第二の幼虫齢の中では、ディスクはestablisは、原発運命を採用する使命を帯びている正確な形状を採用し、セル15〜16の必要な数を生成し、コンパートメントの境界を興。第三の幼虫齢と初期のプレ蛹段階では、成虫は分裂を続け、細胞がそれらの端末の運命16を採用するようにパターニングする。
ショウジョウバエ発生生物学の初期の歴史の中で、成虫は正常な発達との関連で、損失または機能獲得変異体が生存された限られたケースではほぼ独占的に研究した。幼虫および成体組織内の細胞クローン中で分析される致死突然変異のために許可された有糸分裂組換えを誘導するX線の使用。この方法は、幼虫および成体の両方の組織における損失と機能獲得型突然変異を分析するためにトランスジェニック法の導入により改善されている。野生型および変異型の組織の分子景観を説明するための抗体の転写レポーターおよびタンパク質トラップの数も定数であるantly成長。損失を分析し、機能獲得型変異細胞クローンするために、これらの分子マーカーを使用すると、突然変異細胞は、発達中にその野生型いとこから逸脱方法のリアルタイムの理解を得ることがますます可能になった。適切にこれらのツールおよび試薬を利用するためには、閲覧撮影し分析することができる成虫の高品質の製剤を有することが重要である。この原稿の目標は、目を触角複合体( 図1A)の単離および調製のための最適化されたプロトコルを提供することです。また、正常翼、平均棍、T1-T3脚および性器( 図1B-E)を生じるものを含む追加のディスクの多種多様な単離することができる。この手順は、わずかな変更で、ほぼ80年間、 ショウジョウバエ成虫を単離するために使用されている。
ほとんどの遺伝子は、ミュー中に発現されているので、上記のように発達段階ltipleおよび組織の多数では、動物が三齢幼虫期前によく死ぬようにヌル変異体が眼全体に与える影響を研究するために、多くの場合不可能です。 4つの方法は、網膜などの先進の組織の研究は著しくより扱いやすくなりました。最初は、そうでなければ、野生型組織17-19内の変異体細胞クローンを生成するフリッパーゼ(FLP)/フリッパーゼ換えターゲット(FRT)メソッドです。この場合、変異体組織は、緑色蛍光タンパク質(GFP)のような視覚的なマーカーの非存在により識別され、GFPの存在する周囲の野生型組織( 図2D)と比較することができる。二つ目は、導入遺伝子が細胞20の集団において発現している「FLPアウト」方式である。この場合、細胞クローンは、GFPレポーターを欠いている周囲の野生型組織( 図にGFPの存在によって同定され、比較される2E)。第三は、FLP / FRT突然変異体クローンとFLPアウト発現システム21の要素を組み合わせた抑制性細胞マーカー(MARCM)技術とモザイクの分析である。この方法では、導入遺伝子を同時に個体の遺伝子座のための突然変異体である細胞の集団内で表現することができる。 FLPアウトクローンと同様に、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定およびGFPマーカー( 図2F)を欠いている周囲の野生型組織と比較している。最後に、遺伝子及びRNAi構築物は、特異的プロモーター-GAL4構築物の制御下成虫組織内で発現させることができる。変異または過剰発現クローンまたはパターンが直接隣接野生型組織と比較することができるので、これらの4つの方法は、成虫の研究に関心が高まっている。この手順に記載された方法が開発されているように、ショウジョウバエでは、成体組織の後胚発生を研究、研究者、特に目を触角から誘導されるものが、分析のために高品質の組織を得ることができるであろう。個別の研究者は、わずかな変更を行ってきたが、(私たちはここで説明する)この手順のコアは、大部分が変更されていないままである。高品質の組織を得ることが私たちは、この書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは貴重な教育資源として役立つことを願ってい成虫の研究に重要であることから。
この手順は、主に目を触角ディスクの単離およびその後の治療に焦点を当ててきたが、それは翼、平均棍、足や性器ディスク( 図4)を単離および分析するために使用されることに適している。 (目を触角ではなく)これらのディスクを分離するためのプロトコルの唯一の必須修正は、粗い解剖(プロトコルのセクション2)の方法である。第一胸椎の脚(T1)のペアは、幼虫の?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、JPK、元原基の解剖手順を教えるためのドナルドレディとケビンモーセに感謝したいと思います。また、 図1(b)の性器ディスクと抗体については図2(a)、図3のためにブランドンWeasner、フライの汚れのためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターと発達研究ハイブリドーマバンクの目のディスクのボニーWeasnerに感謝します。 CMSは、国立衛生研究所(NIH)GCMSトレーニンググラント(T32-GM007757)、フランク·W·パトナム研究フェローシップ、そしてロバート·ブリッグス研究員からの奨学金によってサポートされています。 JPKは国立眼研究所からの助成金によってサポートされている(R01 EY014863)
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
#5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |