The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
En vesentlig del av post-embryonal utvikling i bananflue, Drosophila melanogaster, foregår innenfor et sett av sac-lignende strukturer som kalles imaginal plater. Disse skivene gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly. Her beskriver vi en protokoll som har blitt optimalisert for å gjenopprette disse platene og forberede dem for analyse med antistoffer, transkripsjons journalister og protein feller. Denne prosedyren er best egnet for tynne vev som imaginal plater, men kan enkelt endres for bruk med tykkere vev som larve hjernen og voksen eggstokk. Den skriftlige protokoll og medfølgende videoen vil veilede leseren / seeren gjennom disseksjon av tredje stadium larver, fiksering av vev, og behandling av imaginal plater med antistoffer. Protokollen kan brukes til å dissekere Imaginal plater fra yngre første og andre stadiums larver i tillegg. Fordelen med denne protokollen er at den er forholdsvis kort, og den har blien optimalisert for den høye kvaliteten bevaring av den dissekerte vev. En annen fordel er at fikseringsfremgangsmåten som er anvendt fungerer godt med overveldende antall av antistoffer som gjenkjenner Drosophila-proteinene. Etter vår erfaring er det et svært lite antall sensitive antistoffer som ikke fungerer godt med denne prosedyren. I slike situasjoner, synes den rette til å være å bruke en alternativ fiksering cocktail mens du fortsetter å følge de retningslinjer som vi har fastsatt for disseksjon trinn og antistoff inkubasjoner.
For mer enn et århundre bananflue, Drosophila melanogaster, har vært en ledende system for å studere utvikling, atferd og fysiologi. Utvikling i fly kan deles inn i to hovedstadier: embryonale og post-embryonale med mye av den sistnevnte finner sted innenfor epitel monolag kalt Imaginal plater 1-3. Tegninger av imaginal plater ble først publisert i 1864 i august Weismann som en del av sin brede monografi om insekt utvikling en. Disse platene begynner sin utvikling under embryogenesen er mønstret i løpet av larvestadier, overleve den massive histolysis av de tidlige pupal stadier, og til slutt gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly 1-14. Under larveutvikling hver plate gjør flere kritiske avgjørelser angående skjebne, form og størrelse. Innenfor de første og andre larve instars, er platene skal vedta en primær skjebne, etahengsle kupé grenser, vedta riktig form og generere den nødvendige antall celler 15-16. I løpet av tredje larve instar og tidlig pre-pupal scenen, de imaginal plater fortsette å dele seg og blir mønstret som celler vedta sine terminal skjebner 16.
Under den tidlige historien Drosophila utviklingsbiologi, ble imaginal plater studert nesten utelukkende i sammenheng med normal utvikling og i de begrensede tilfeller der et tap eller gevinst-of-funksjon mutant var levedyktig. Bruken av røntgenstråler for å indusere mitotisk rekombinasjon tillatt for dødelige mutasjoner for å bli analysert i cellekloner innenfor larve og voksne vev. Denne metoden har blitt forbedret ved innføringen av transgene metoder for å analysere tap og vinning-of-funksjon mutasjoner i både larver og voksne vev. Antallet antistoffer, transkripsjons reportere og protein feller for å beskrive den molekylære landskapet av villtype og mutant vev er også constantly økende. Ved hjelp av disse molekylære markører for å analysere tap og få-av-funksjon mutant cellekloner har gjort det stadig mulig å oppnå en sanntids forståelse av hvordan mutante celler avviker fra deres villtype fett under utvikling. Til riktig dra nytte av disse verktøyene og reagenser er det avgjørende å ha høy kvalitet preparater av imaginal plater som kan vises, fotografert og analysert. Målet med dette manuskriptet er å gi en optimalisert protokoll for isolering og utarbeidelse av øye-antennal plate kompleks (figur 1A). Den kan også med hell brukes for å isolere et bredt utvalg av flere plater, inkludert de som gir opphav til de vinger, halteres, T1-T3 ben og kjønnsorganene (figur 1B-E). Denne prosedyren, med mindre modifikasjoner, har blitt brukt til å isolere imaginal plater fra Drosophila i nesten åtti år.
Som beskrevet ovenfor, siden de fleste genene blir uttrykt under multiple utviklingsstadier og i en rekke vev, er det ofte umulig å studere effekter som null mutanter har på hele øyet som dyret dør i god tid før det tredje instar larvestadiet. Fire metoder har gjort studier av mer utviklede vev slik som retina betydelig mer medgjørlig. Den første er den Flippase (FLP) / Flippase Rekombinasjon Target (FRT) metode for generering av mutante cellekloner i en ellers vill type vev 17-19. I dette tilfellet den mutante vev blir identifisert ved fravær av en visuell markør slik som grønt fluorescerende protein (GFP) og kan bli sammenlignet med det omliggende vev villtype hvori GFP er til stede (figur 2D). Den andre er den «FLP-out"-metoden, hvor en transgenet blir uttrykt i en populasjon av celler 20. I dette tilfellet cellekloner er identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er Mosaic Analyse med et Repressible Cell Marker (MARCM) teknikken, som kombinerer elementer av FLP / FRT mutant klone og FLP-out ekspresjonssystemer 21. Med denne metoden et transgen kan uttrykkes i en populasjon av celler som er samtidig en individuell mutant for genetisk locus. Som FLP-ut kloner, er MARCM kloner identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP markør (figur 2F). Og til slutt, kan genene og RNAi konstruerer uttrykkes innen imaginal vev under kontroll av spesifikke promoter-Gal4 konstruksjoner. Disse fire metoder har økt interessen for å studere imaginal plater siden mutant eller over-uttrykk kloner eller mønstre kan sammenlignes direkte med tilstøtende villtype vev. Metoden som beskrives i denne prosedyren er utviklet slik at forskere som studerer den post-embryoutvikling av voksne vev i Drosophila,spesielt de som er avledet fra det øye-antennal plate, vil være i stand til å oppnå høy kvalitet vev for analyse. Selv om enkelte forskere har gjort små endringer, har kjernen i denne prosedyren (som vi beskriver her) holdt seg stort sett uendret. Siden oppnå høy kvalitet vev er kritisk til studiet av de imaginal plater Vi håper dette skriftlig protokoll og medfølgende videoen vil tjene som en verdifull undervisning ressurs.
Selv om denne fremgangsmåten har i stor grad fokusert på isolering og påfølgende behandling av øye-antennal plater, det er mottagelig for å bli brukt for å isolere og analysere vingen, haltere, ben og genital-plater (figur 4). Den eneste nødvendige modifikasjon av protokollen for å isolere disse platene (i motsetning til øyet-antennal plate) er metoden for grov disseksjon (§ 2 i protokollen). Det første ben torakale (T1) paret er funnet på den fremre av larven og kan utvinnes ved å følge …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Donald Ready og Kevin Moses for undervisning JPK den opprinnelige imaginal platen disseksjon prosedyren. Vi takker også Bonnie Weasner for genital platen i figur 1B og øyet platen i figur 2A, Brandon Weasner for figur 3, Bloomington Drosophila Stock Center for flue flekker og utviklingsstudier Hybridom Bank for antistoffer. CMS har vært støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Stipendiat, og Robert Briggs Stipendiat. JPK er støttet av et stipend fra National Eye Institute (R01 EY014863)
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
#5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |