Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Uma parcela significativa do desenvolvimento pós-embrionário na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, ocorre dentro de um conjunto de estruturas de saco-como chamados discos imaginais. Estes discos de dar origem a uma elevada percentagem de estruturas de adulto que são encontrados dentro da mosca adulta. Aqui nós descrevemos um protocolo que foi otimizado para recuperar estes discos e prepará-los para a análise com anticorpos, repórteres de transcrição e armadilhas de proteína. Este procedimento é o mais adequado para os tecidos finos como discos imaginais, mas pode ser facilmente modificado para utilização com tecidos mais espessos, tais como o cérebro adulto e ovário de larvas. O protocolo escrito e vídeo que acompanha irá orientar o leitor / espectador através da dissecção de larvas de terceiro estádio, a fixação de tecidos e tratamento de discos imaginais com anticorpos. O protocolo pode ser utilizado para dissecar discos imaginais de jovens larvas de primeiro e segundo instar, bem. A vantagem deste protocolo é de que é relativamente curta e tem seren optimizado para a preservação de alta qualidade do tecido dissecado. Outra vantagem é que o processo de fixação, que é empregue funciona bem com o número esmagadora de anticorpos que reconhecem as proteínas de Drosophila. Em nossa experiência, há um número muito pequeno de anticorpos sensíveis que não funcionam bem com este procedimento. Nessas situações, o remédio parece ser a utilização de um cocktail de fixação alternativo, continuando a seguir as orientações que temos estabelecidos para as etapas de dissecação e incubações de anticorpos.

Introduction

Por mais de um século, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido um sistema premier para estudar o desenvolvimento, comportamento e fisiologia. Desenvolvimento na mosca pode ser dividido em duas grandes etapas: embrionárias e pós-embrionárias com muito de este último ter lugar dentro de monocamada epitélios chamados discos imaginais ^1-3. Desenhos de discos imaginais foram publicados pela primeira vez em 1864 por August Weismann como parte de sua ampla monografia sobre o desenvolvimento do inseto ^1. Estes discos começam a se desenvolver durante a embriogênese, são modelados durante os estágios larvais, sobreviver à histólise maciça dos pupa primeiros, e, finalmente, dar origem a uma elevada percentagem de estruturas adultas que são encontrados dentro da mosca adulta ^1-14. Durante o desenvolvimento larval cada disco faz várias decisões críticas sobre o destino, forma e tamanho. Dentro do primeiro e segundo estágios larvais, os discos têm a tarefa de adotar um destino primário, establishing limites dos compartimentos, adotando a forma correta e gerar o número necessário de células ^15-16. Durante o terceiro estágio larval e início do estágio de pré-pupa, os discos imaginais continuam a se dividir e são modelados como células adotar seus destinos terminal ^16.

Durante o início da história da biologia do desenvolvimento Drosophila, discos imaginais foram estudados quase exclusivamente no contexto do desenvolvimento normal e nos casos limitados em que a perda ou mutante ganho de função era viável. A utilização de Raios-X para induzir a recombinação mitótico permitido para mutações letais para ser analisada em clones de células no interior dos tecidos de larvas e de adultos. Este método tem sido melhorada através da introdução de métodos transgênicos para analisar a perda e ganho de função de mutações em ambos os tecidos larvais e adultas. O número de anticorpos, repórteres de transcrição e de proteínas armadilhas para descrever a paisagem molecular de tipo selvagem e mutantes de tecidos é também constantly crescente. Usando esses marcadores moleculares para analisar a perda e ganho de função clones de células mutante tornou cada vez mais viável para obter uma compreensão em tempo real de como as células mutantes se desviar de seus primos de tipo selvagem durante o desenvolvimento. Para aproveitar de forma adequada essas ferramentas e reagentes é fundamental ter preparações de alta qualidade de discos imaginais que podem ser vistos, fotografados e analisados. O objetivo deste manuscrito é proporcionar um protocolo optimizado para o isolamento e a preparação do complexo de disco olho-antenal (Figura 1A). Também pode ser utilizado com êxito para isolar uma grande variedade de discos adicionais, tais como aqueles que dão origem às asas, pernas halteres, T1-T3 e os órgãos genitais (Figura 1B-E). Este procedimento, com pequenas modificações, foi usado para isolar discos imaginais de Drosophila por quase 80 anos.

Como descrito acima, uma vez que a maioria dos genes são expressos durante multiple fases de desenvolvimento e de uma grande variedade de tecidos, ela é muitas vezes impossível para estudar os efeitos que os mutantes nulos tem em todo o olho, o animal morre muito antes do estágio de larva de terceiro instar. Quatro métodos de ter feito o estudo dos tecidos mais desenvolvidos, como a retina significativamente mais tratável. A primeira é o método flipase (FLP) / flipase Recombinação alvo (FRT) de geração de clones de células mutantes dentro de uma outra forma de tecido tipo selvagem ^17-19. Neste exemplo, o tecido mutante é identificado pela ausência de um marcador visual tal como uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) e pode ser comparado com o tecido circundante do tipo selvagem, em que está presente a GFP (Figura 2D). A segunda é o método "flp-out" em que um transgene é expresso numa população de células ^20. Neste exemplo, os clones de células são identificadas pela presença de GFP e em comparação com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o repórter GFP (Figura2E). A terceira é a Análise mosaico com uma técnica de marcador de células reprimível (MARCM), que combina elementos do clone mutante FLP / FRT e sistemas de expressão flp-out ^21. Com este método de um transgene podem ser expressas dentro de uma população de células que são simultaneamente mutante para um locus genético individual. Como os clones flp-out, MARCM clones são identificados pela presença de GFP e comparado com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o marcador GFP (Figura 2F). E, por fim, as construções de genes e de ARNi pode ser expresso em tecidos imaginais sob o controlo de construções de promotor GAL4-específicos. Estes quatro métodos têm aumentado o interesse em estudar discos imaginais desde clones ou padrões mutantes ou sobre-expressão pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. O método descrito neste procedimento foi desenvolvido para que os pesquisadores que estudam o desenvolvimento pós-embrionário de tecidos adultos em Drosophila,particularmente aquelas derivadas a partir do disco de olho-antenais e será capaz de se obterem tecidos de alta qualidade para a análise. Embora os pesquisadores individuais fizeram pequenas modificações, o cerne deste processo (que descrevemos aqui) se manteve praticamente inalterado. Desde a obtenção de tecido de alta qualidade é fundamental para o estudo dos discos imaginais Esperamos que este protocolo escrito e vídeo que acompanha irá servir como um recurso valioso de ensino.

Protocol

1 Preparação de Larvas Preencha de 35 mm placa de Petri com tampão dissecção. Coloque larvas em placa de Petri e permitir-lhes nadar por alguns minutos (etapa de auto-limpeza). Transferência das larvas para um tanque de tampão numa placa de dissecação dissecção à base de silicone. Esta associação deve situar-se a aresta da placa. A placa de dissecação consiste de uma solução de silicone, que foi vazada e endurecida dentro de uma placa de Petri de vidro. Usando u…

Representative Results

O método que é descrito acima, de forma fiável produz material de alta qualidade para a análise com sondas in situ, nos repórteres de transcrição, armadilhas de proteínas e anticorpos. Na Figura 1 exibir discos olho-de antena, genitais, asa, haltere e pernas que são rotineiramente recuperados com este método. Estes discos foram tratados com um fluoróforo faloidina-conjugado, que se liga à actina F e, por conseguinte, define cada célula. Se o tecido tiver sido fixado correctamente, …

Discussion

Embora este procedimento concentrou-se principalmente sobre o isolamento e tratamento subsequente dos discos de olho-antenais e que é passível de ser utilizado para isolar e analisar a asa, haltere, perna e discos genital (Figura 4). A única modificação necessária do protocolo para isolar estes discos (em oposição ao disco olho-antenal) é o método de dissecação grosseira (seção 2 do protocolo). A primeira perna (T1) par torácica é encontrada na anterior da larva e pode ser recuperado, se…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples