The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Una parte importante del desarrollo post-embrionario en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se lleva a cabo dentro de un conjunto de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. Estos discos dan lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta. Aquí se describe un protocolo que ha sido optimizada para recuperar estos discos y prepararlos para el análisis con anticuerpos, marcadores transcripcionales y trampas de proteína. Este procedimiento es el más adecuado para los tejidos finos como los discos imaginales, pero se puede modificar fácilmente para su uso con tejidos más gruesos, como el cerebro y el adulto ovario larval. El protocolo escrito y video que acompaña guiarán el lector / espectador a través de la disección de las larvas de tercer estadio, la fijación de tejido, y el tratamiento de los discos imaginales con anticuerpos. El protocolo se puede utilizar para diseccionar discos imaginales de larvas jóvenes primero y segundo instar también. La ventaja de este protocolo es que es relativamente corto y tiene seres optimizado para la preservación de la alta calidad del tejido diseccionado. Otra ventaja es que el procedimiento de fijación que se emplea funciona bien con el abrumador número de anticuerpos que reconocen proteínas de Drosophila. En nuestra experiencia, hay un número muy pequeño de anticuerpos sensibles que no funcionan bien con este procedimiento. En estas situaciones, el remedio parece ser el uso de un cóctel de fijación alternativo sin dejar de seguir las pautas que hemos establecidos para los pasos de disección e incubaciones de anticuerpos.
Durante más de un siglo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido un sistema principal para estudiar el desarrollo, comportamiento y fisiología. Desarrollo en la mosca se puede dividir en dos grandes etapas: embrionarias y post-embrionarias con gran parte de la toma lugar dentro de este último epitelios monocapa llamadas discos imaginales 1-3. Dibujos de los discos imaginales se publicaron por primera vez en 1864 por August Weismann como parte de su amplia monografía sobre el desarrollo del insecto 1. Estos discos comienzan su desarrollo durante la embriogénesis, se modelan durante las etapas larvales, sobrevivir a la histolysis masiva de las primeras etapas de pupa, y en última instancia, dar lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta 1-14. Durante el desarrollo larvario cada disco hace varias decisiones críticas con respecto a la suerte, forma y tamaño. Dentro de la primera y segunda etapas larvales, los discos tienen la tarea de adoptar un destino primario, establisHing límites de compartimento, la adopción de la forma correcta y generar el número necesario de células 15-16. Durante el tercer estadio larval y la etapa pre-pupa temprano, los discos imaginales continúan dividiéndose y se modelan como células adoptan sus destinos terminales 16.
Durante la historia temprana de la biología del desarrollo de Drosophila, discos imaginales se estudiaron casi exclusivamente en el contexto del desarrollo normal y en los pocos casos en los que una pérdida o mutante de ganancia de función era viable. El uso de rayos X para inducir la recombinación mitótica permitido para las mutaciones letales para ser analizada en clones de células dentro de los tejidos de larvas y adultos. Este método ha sido mejorado por la introducción de métodos transgénicos para analizar la pérdida y ganancia de función de las mutaciones en ambos tejidos de larvas y adultos. El número de anticuerpos, reporteros transcripcionales y trampas de proteína para describir el paisaje molecular de tipo salvaje y mutantes tejidos es también constndo RT crecimiento. El uso de estos marcadores moleculares para analizar la pérdida y ganancia de función de clones de células mutante ha hecho cada vez más factible obtener una comprensión en tiempo real de cómo las células mutantes se desvían de sus primos de tipo salvaje durante el desarrollo. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas y reactivos que es fundamental contar con los preparativos de la alta calidad de los discos imaginales que se pueden ver, fotografiados y analizados. El objetivo de este manuscrito es proporcionar un protocolo optimizado para el aislamiento y la preparación del complejo de disco ojo antenal (Figura 1A). También puede ser utilizado con éxito para aislar una amplia variedad de discos adicionales, incluyendo los que dan lugar a las alas, haleteres, piernas T1-T3 y los genitales (Figura 1B-E). Este procedimiento, con modificaciones menores, se ha utilizado para aislar los discos imaginales de Drosophila durante casi ochenta años.
Como se describió anteriormente, ya que la mayoría de los genes se expresan durante multiple etapas de desarrollo y en una multitud de tejidos, a menudo es imposible estudiar los efectos que tienen los mutantes nulos en todo el ojo como el animal muere mucho antes de la etapa de larva de tercer instar. Cuatro métodos han hecho el estudio de los tejidos más desarrollados, como la retina significativamente más manejable. El primero es el método flipasa (FLP) / flipasa Recombinación Target (FRT) de generar clones de células mutantes dentro de un tipo de tejido de otro modo salvaje 17-19. En este caso, el tejido mutante se identifica por la ausencia de un marcador visual tal como la proteína fluorescente verde (GFP) y puede ser comparado con el tejido circundante de tipo salvaje en la que está presente GFP (Figura 2D). El segundo es el método "flp-out" en el que un transgén se expresa en una población de células 20. En este caso, los clones de células se identifican por la presencia de GFP y se compararon con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del reportero GFP (Figura2E). El tercero es el Análisis Mosaico con una técnica de marcador celular reprimible (MARCM), que combina elementos de los sistemas de expresión de FLP-Salida 21 clon mutante FLP / FRT y. Con este método un transgén puede ser expresado dentro de una población de células que son simultáneamente mutante para un locus genético individual. Como clones flp-out, MARCM clones se identifican por la presencia de GFP y se comparan con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del marcador de GFP (Figura 2F). Y por último, los genes y las construcciones de ARNi se pueden expresar dentro de los tejidos imaginales bajo el control de constructos específicos promotor GAL4. Estos cuatro métodos han aumentado el interés en el estudio de los discos imaginales desde clones mutantes o patrones o sobre-expresión se pueden comparar directamente con los tejidos de tipo natural adyacente. El método descrito en este procedimiento ha sido desarrollado para que los investigadores que estudian el desarrollo post-embrionario de los tejidos adultos en Drosophila,especialmente las derivadas de la disco-ojo antenal, podrán obtener tejido de alta calidad para el análisis. Aunque los investigadores individuales han hecho ligeras modificaciones, el núcleo de este procedimiento (que se describe aquí) se ha mantenido prácticamente inalterada. Desde la obtención de tejido de alta calidad es fundamental para el estudio de los discos imaginales Esperamos que este protocolo escrito y video que acompaña servirán como recurso didáctico valioso.
Aunque este procedimiento se ha centrado en gran medida en el aislamiento y el tratamiento posterior de los discos de ojo de antenal, es susceptible de ser utilizado para aislar y analizar el ala, haltere, la pierna y discos genitales (Figura 4). La única modificación necesaria del protocolo para el aislamiento de estos discos (en comparación con el disco de ojos antenal) es el método de disección gruesa (sección 2 del protocolo). El primer tramo (T1) par torácica se encuentra en la parte anterio…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Donald Ready y Kevin Moisés para enseñar JPK el procedimiento de disección disco imaginal originales. También queremos agradecer a Bonnie Weasner para el disco genital en la Figura 1B y el ojo de disco en la Figura 2A, Brandon Weasner para la Figura 3, el Stock Center Bloomington Drosophila para las manchas de moscas y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de anticuerpos. CMS ha sido apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), el Frank W. Putnam Becas de Investigación, y el Robert Briggs Beca de Investigación. JPK es apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Ojo (R01 EY014863)
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
#5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |