Dissektion och immunfärgning av imaginal skivor från<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

En betydande del av post-embryonal utveckling i bananflugan, Drosophila melanogaster, sker inom en uppsättning av säck-något liknande strukturer som kallas imaginal skivor. Dessa skivor ger upphov till en hög procentuell andel av vuxna strukturer som finns inom den vuxna flugan. Här beskriver vi ett protokoll som har optimerats för att återvinna dessa skivor och förbereda dem för analys med antikroppar, transkriptions reportrar och protein fällor. Detta förfarande är bäst lämpad för tunna vävnader såsom imaginal skivor, men kan lätt modifieras för användning med tjockare vävnader såsom larv hjärnan och vuxen äggstock. Den skriftliga protokoll och tillhörande video guidar läsaren / tittaren genom dissektion av tredje stadiet larver, fixering av vävnad, och behandling av imaginal skivor med antikroppar. Protokollet kan användas för att dissekera imaginal skivor från yngre första och andra instar larver samt. Fördelen med detta protokoll är att det är relativt kort och det har att varasv optimerad för höga bevara den dissekerade vävnaden kvaliteten. En annan fördel är att fixeringen förfarande som används fungerar bra med det överväldigande antalet antikroppar som känner igen Drosophila proteiner. Enligt vår erfarenhet finns det ett mycket litet antal känsliga antikroppar som inte fungerar bra med den här proceduren. I dessa situationer tycks botemedlet vara att använda en alternativ fixerings cocktail samtidigt fortsätta att följa de riktlinjer som vi har satt fram för dissektion steg och inkubationer antikroppar.

Introduction

I mer än ett århundrade bananflugan, Drosophila melanogaster, har varit ett ledande system för att studera utvecklingen, beteende och fysiologi. Utvecklingen i gylfen kan delas in i två faser: embryonala och post embryonala med mycket av den senare äger rum inom monolager epitel kallas imaginal skivor ^1-3. Teckningar av imaginal skivor publicerades först i 1864 av August Weismann som en del av hans breda monografi om insekts utveckling ^1. Dessa skivor börjar sin utveckling under fosterutvecklingen, är mönstrade under larvstadierna, överleva den massiva histolysis av de tidiga PUPP stadierna, och i slutändan leda till en hög andel av vuxna strukturer som finns inom vuxen flyga ^1-14. Under larvutveckling varje skiva gör flera kritiska beslut om ödet, form och storlek. Inom de första och andra larv instars, är skivorna uppgift att anta en primär öde, establisHing områdesgränser, anta rätt form och generera det erforderliga antalet celler ^15-16. Under tredje larv stadiet och tidig pre-puppstadium, de imaginal skivor fortsätter att dela sig och är mönstrade som celler antar deras kopplings öden ^16.

Under tidiga historia Drosophila utvecklingsbiologi, har imaginal skivor studerade nästan uteslutande i samband med normal utveckling och i de begränsade fall där en förlust eller vinst-of-function mutant var lönsamt. Användningen av röntgenstrålar för att inducera mitotisk rekombination tillåts för dödliga mutationer som ska analyseras i cellkloner inom larver och vuxna vävnader. Detta förfarande har förbättrats genom införande av transgena metoder för att analysera förlusten och få-av-funktionsmutationer i båda larv och vuxna vävnader. Antalet antikroppar, transkriptions reportrar och protein fällor för att beskriva den molekylära landskap av vildtyp och mutant vävnader är också constoch art växer. Med hjälp av dessa molekylära markörer för att analysera förlusten och få-av-funktionen mutant cellkloner har gjort det allt möjligt för att få en realtids förståelse för hur muterade celler avviker från sina vilda kusiner typ under utveckling. För att korrekt dra nytta av dessa verktyg och reagens är det viktigt att ha höga beredningar av imaginal skivor som kan visas, fotograferade och analyserade kvalitet. Målet med detta manuskript är att ge ett optimerat protokoll för isolering och beredning av ögon antennal skivkomplex (Figur 1A). Den kan också med framgång användas för att isolera ett brett utbud av ytterligare skivor inklusive sådana som ger upphov till de vingar, halteres, T1-T3 ben och könsorganen (Figur 1B-E). Detta förfarande, med smärre modifikationer, använts för att isolera imaginal skivor från Drosophila för nästan åttio år.

Som beskrivits ovan, eftersom de flesta gener uttrycks under multiple stadier av utveckling och i en mångfald av vävnader, är det ofta omöjligt att studera effekterna att null mutanter har på hela ögat som djuret dör väl innan den tredje instar larvstadiet. Fyra metoder har gjort studier av mer utvecklade vävnader såsom näthinnan betydligt mer lätthanterlig. Den första är den Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) metod för att generera muterade cellkloner i en annars vildtyp vävnad ^17-19. I detta fall är den mutanta vävnad identifieras genom frånvaron av en visuell markör såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och kan jämföras med den omgivande vildtyp vävnad i vilken GFP är närvarande (figur 2D). Den andra är metoden "FLP-ut", i vilken en transgenen uttrycks i en population av celler ^20. I detta fall är de cellkloner identifierades genom närvaron av GFP och jämfört med den omgivande vildtyp vävnad som saknar GFP reporter (Figur2E). Den tredje är den Mosaik analys med en undertryck Cell Marker (MARCM) teknik, som kombinerar element av FLP / FRT mutant klon och FLP-out expressionssystem ^21. Med den här metoden en transgen kan uttryckas inom en population av celler som samtidigt mutant för en enskild genetiskt lokus. Liksom FLP-ut kloner, är marcm kloner identifierades genom närvaron av GFP och jämfört med den omgivande vildtyp vävnad som saknar den GFP-markör (Figur 2F). Och slutligen, kan de gener och RNAi konstruktioner uttryckas inom imaginal vävnad under kontroll av specifika promotor-GAL4 konstruktioner. Dessa fyra metoder har ökat intresset för att studera imaginal skivor sedan muterade eller överuttryck kloner eller mönster kan direkt jämföras med intilliggande vild vävnadstyp. Metoden som beskrivs i detta förfarande har utvecklats för att forskare som studerar den post-embryonal utveckling av vuxna vävnader i Drosophila,särskilt sådana som framställts från ögat-antennal skiva, kommer att kunna erhålla hög kvalitet vävnad för analys. Även om enskilda forskare har gjort smärre ändringar har kärnan i detta förfarande (som vi beskriver här) i stort sett oförändrad. Eftersom få högkvalitativ vävnad är avgörande för studiet av imaginal skivor vi hoppas denna skriftliga protokoll och tillhörande video kommer att fungera som en värdefull undervisningsresurs.

Protocol

1. Framställning av Larver Fyll en 35 mm petriskål med dissektion buffert. Placera larver i petriskål och tillåta dem att simma runt i några minuter (självrengörande steg). Överför larver till en pool av dissektion buffert på ett silikonbaserat dissektion plattan. Denna pool bör vara vid en kant av plattan. Den dissekering plattan består av en silikonlösning som har hällts och härdas i en glaspetriskål. Med hjälp av en pasteur-pipett, placera en större pool av d…

Representative Results

Den metod som beskrivs ovan tillförlitligt producerar högkvalitativt material för analys med in situ-prober, transkription reportrar, protein fällor och antikroppar. I figur 1 visar vi eye-antenn, genitala, vinge, haltere och ben skivor som rutin återvinns med denna metod. Dessa skivor har behandlats med en phalloidin-konjugerad fluorofor, som binder till F-aktin och därför beskriver varje cell. Om vävnaden har fastställts på rätt sätt då den morfogenetiska fåra i ögat skiva kant…

Discussion

Även om detta förfarande har till stor del fokuserat på isolering och efterföljande behandling av ögon antennal skivor är det mottagligt för att användas för att isolera och analysera vingen, haltere, ben och genitala skivor (Figur 4). Det enda som krävs ändring av protokollet för att isolera dessa skivor (i motsats till den ögon antennal skiva) är metoden för grova dissektion (§ 2 i protokollet). Den första bröstbenet (T1) paret hittas vid den främre av larven och kan återvinnas gen…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples