عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.
في هذا البروتوكول، ونحن تقديم المواد المطلوبة، وإجراءات لجعل C تعديلها. legans ه التعويد والاستنساخ وسائل الإعلام (mCeHR). بالإضافة إلى ذلك، فإن الخطوات لفضح والتأقلم C. ايليجانس نمت على E. وصفت وسائل الإعلام القولونية إلى ممحوضة السائل. أخيرا، والتجارب التي تستخدم المصب ممحوضة C. توضيح ايليجانس الفوائد من هذا الإجراء. القدرة على تحليل وتحديد C. وقد تجلى ايليجانس شرط المغذيات التي تنمو N2 البرية من نوع الديدان في وسائل الإعلام السائل ممحوضة مع اختلاف تركيزات الهيم. يمكن تكرارها هذا الإجراء مع المواد المغذية الأخرى لتحديد تركيز الأمثل للنمو الدودة والتنمية، أو لتحديد الآثار السمية للعلاجات الدوائية. وتم تحديد آثار تركيزات الهيم متنوعة على نمو البرية من نوع الديدان من خلال الملاحظة المجهرية النوعية وquantitating ركان عدد من الديدان التي نمت في كل تركيز الهيم. بالإضافة إلى ذلك، تأثير تركيزات المغذيات متنوعة يمكن أن يعاير من خلال الاستفادة من الديدان التي تعبر عن أجهزة استشعار الفلورسنت التي تستجيب للتغيرات في العناصر الغذائية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، تم إنتاج عدد كبير من الديدان بسهولة لتوليد C. ايليجانس المعدلة وراثيا باستخدام microparticle القصف.
الديدان الخيطية التربة وانواع معينة ايليجانس، هو كائن نموذج قوي يستخدم في العديد من الدراسات من علم الوراثة لعلم السموم. نتيجة لحجمه 1 مم، الوقت جيل السريع لأربعة أيام، وسهولة زراعة، وأرقام ذرية كبيرة، وقد تم استخدام هذه الديدان الخيطية في عدد من شاشات الوراثية والدوائية 1، 2. الباحثون الاستفادة من هذه الدودة لتحديد الجزيئات ومسارات المحفوظة في نظم الفقاريات. وتشمل هذه المسارات إشارات موت الخلايا، ومسارات الشيخوخة والتمثيل الغذائي، والجهاز العصبي 3-6. بالإضافة إلى ذلك، شفافية C. ايليجانس يسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا باستخدام بروتين فلوري للصحفيين، والتي يمكن تصور مباشرة لتحليل أنماط التعبير الجيني والبروتين التعريب.
في العديد من الدراسات ومثقف هذه الديدان الخيطية على سطح القائم على أجار الصلبة باستخدام الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM) لوحات أو في لترالثقافات iquid المصنف مع كولاي كمصدر للغذاء 7،8. ويمكن لهذه المصادر الغذائية البكتيرية نخلط الدراسات البيوكيميائية وعلم السموم مع تدخل من البكتيريا من المنتجات التي تؤثر على تفسير النتائج. من أجل تجنب هذه الآثار المركبة، C. ايليجانس يمكن تربيتها في وسائل الإعلام السائل ممحوضة أن يخلو من البكتيريا كمصدر للغذاء. باستخدام هذه الوسائط، ونحن مثقف بنجاح الملايين من الديدان متزامنة للغاية بالنسبة للعديد من المعايير C. ايليجانس البروتوكولات بما في ذلك تحليل ميكروأري الجينات ينظم بشكل مختلف في C. ايليجانس يتعرضون لتركيزات مختلفة الهيم، وإنتاج الديدان المعدلة وراثيا باستخدام القصف الجينات. ويعرف كيميائيا هذه الوسائط ومعدلة من وصفة الأصلي صاغها الدكتور اريك كليج 9. باستخدام هذه الوسائط mCeHR، حددنا الجينات المسؤولة عن الهيم التوازن بنجاح، ويشار إلى الجينات كما تستجيب الهيم (HRG ق) 10، التي من شأنها أنلم يكن ممكنا في ظل ظروف النمو العادية التي تستخدم لوحات أجار NGM المصنف مع E. القولونية.
في هذا البروتوكول وصفنا الإجراء لإدخال وصيانة C. ايليجانس نمت على E. كولاي إلى mCeHR ممحوضة واستخدام هذه الطريقة للحصول على عدد كبير من الديدان المعدلة وراثيا لإنتاج C. خطوط ايليجانس باستخدام microparticle القصف. كما أننا الدراسات الحالية التي تظهر جدوى استخدام وسائل الإعلام ممحوضة لتحديد الاحتياجات الغذائية للC. ايليجانس باستخدام الهيم كمثال على ذلك. تظهر هذه الدراسات أن استخدام وسائل الإعلام mCeHR يسمح للنمو السريع في عدد كبير من C. ايليجانس للعديد من التطبيقات المستخدمة من قبل الباحثين المصب دودة.
في هذا البروتوكول نقدم ممحوضة mCeHR سائل الإعلام السائل تعديل يسمح السريع C. الجيل ايليجانس مع إنتاج عدد كبير من الديدان. ويبين هذا الإعلام العديد من المزايا كما تزرع الديدان دون تلويث E. كولاي أو مشتقات البكتيرية ويمكن استغلالها في الدراسات الغذائية والس…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للHealthGrants DK85035 وDK074797 (IH).
MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
Thymine | Sigma | T0376 | |
N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
Biotin | Sigma | B-4639 | |
Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
Niacin | Sigma | N-0761 | |
Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
or | |||
Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |