Kweken<em> Caenorhabditis elegans</em > In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes
Summary
C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.
Abstract
In dit protocol, presenteren we de benodigde materialen, en de procedure voor het maken van aangepaste C. E legans Gewenning en Reproductie media (mCeHR). Bovendien, de stappen voor het blootstellen en acclimatiseren C. elegans gekweekt op E. coli om vloeibare media axenische worden beschreven. Tenslotte downstream experimenten die axenic C. gebruiken elegans illustreren de voordelen van deze procedure. Kunnen analyseren en bepalen C. elegans voedingsstoffen eis werd geïllustreerd door de groeiende N2 wild type wormen in axenische vloeibare media met verschillende concentraties heem. Deze procedure kan worden herhaald met andere voedingsstoffen om de optimale concentratie voor groei en ontwikkeling worm bepalen of de toxische effecten van behandeling met geneesmiddelen te bepalen. De effecten van verschillende concentraties heem op de groei van wildtype wormen werden bepaald door kwalitatieve microscopische waarneming en kwantificeren tHij aantal wormen die groeide in elk heem concentratie. Bovendien kan het effect van verschillende concentraties nutriënten worden getest door gebruik te maken van wormen die fluorescerende sensoren die reageren op veranderingen in de voedingsoplossing van belang uit te drukken. Bovendien werden een groot aantal wormen gemakkelijk geproduceerd voor het genereren van transgene C. elegans met bombardement met microdeeltjes.
Introduction
De bodem nematode Caenorhabditis elegans, is een krachtige modelorganisme gebruikt in tal van studies van de genetica tot toxicologie. Door de 1 mm grootte, korte generatietijd vier dagen kweekgemak en grote aantallen nakomelingen zijn deze nematoden is gebruikt in een aantal genetische en farmacologische screens 1, 2. Onderzoekers profiteren van deze worm aan moleculen en wegen bewaard in gewervelde systemen te identificeren. Deze routes omvatten celdood signalen, paden van het ouder worden en het metabolisme en het zenuwstelsel 3-6. Bovendien, de transparantie van C. elegans maakt het genereren van transgene lijnen met fluorescerende proteïne reporters, die direct gevisualiseerd kunnen worden om genexpressiepatronen en eiwit lokalisatie analyseren.
In veel studies deze nematode wordt gekweekt op een stevige agar oppervlak met behulp van nematode groeimedium (NGM) platen of in liquid culturen bezaaid met Escherichia coli als voedselbron 7,8. Deze bacteriële voedselbronnen kunnen biochemische en toxicologische studies verwarren met interferentie van bacteriële bijproducten die de interpretatie van de resultaten. Om deze effecten te voorkomen compounding, C. elegans kan worden gekweekt in een axenische vloeibare media die verstoken is van bacteriën als voedselbron. Met behulp van deze media, hebben we met succes gekweekt miljoenen hoogst gesynchroniseerde wormen voor vele standaard C. elegans protocollen waaronder microarray analyse van differentieel gereguleerde genen in C. elegans blootgesteld aan verschillende concentraties heem en productie van transgene wormen middels gen bombardement. Deze media is chemisch gedefinieerd en gewijzigd van een origineel recept van Dr Eric Clegg 9 geformuleerd. Met deze mCeHR media, hebben we met succes geïdentificeerde genen betrokken bij homeostase heem, genoemd heem responsieve genen (HRG s) 10, die zouniet mogelijk geweest in de reguliere groei omstandigheden die NGM agar platen geënt met E. benutten coli.
In dit protocol beschrijven we de procedure voor het invoeren en bijhouden van C. elegans gekweekt op E. coli de axenic mCeHR en gebruik deze methode om een groot aantal wormen te vinden voor het produceren van transgene C. elegans lijnen met behulp van microdeeltjes bombardement. We aanwezig studies die het nut van het gebruik axenic media voor het bepalen van de nutritionele behoefte C. tonen elegans gebruik heem als voorbeeld. Deze studies tonen aan dat het gebruik mCeHR media maakt snelle groei van een groot aantal C. elegans voor vele downstream toepassingen gebruikt door worm onderzoekers.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol presenteren we een gemodificeerde axenische vloeibare media mCeHR dat zorgt voor een snelle C. elegans generatie met productie van een groot aantal wormen. Deze media toont een aantal voordelen zoals de wormen worden geteeld zonder vervuilen E. coli of bacteriële bijproducten en kan in voedings-en toxicologisch onderzoek worden benut. Het gebruik van E. coli of andere bacteriën in deze studies heeft verschillende nadelen. Bijvoorbeeld kan de groei van de bacteriën onder vers…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of HealthGrants DK85035 en DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Referências
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genética. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
