סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את החומרים דרושים, ואת ההליך להכנת C שונה. Legans דואר מדיה הרגלה והרבייה (mCeHR). בנוסף, הצעדים לחשיפה והתאקלמות ג elegans גדל על E. coli לaxenic תקשורת נוזלית מתוארים. לבסוף, ניסויים במורד הזרם לנצל ג axenic elegans להמחיש את היתרונות של הליך זה. היכולת לנתח ולקבוע ג הדרישה התזונתית elegans שהומחש על ידי גידול תולעים מסוג בר N2 בתקשורת נוזלית axenic עם ריכוזי heme שונים. הליך זה יכול להיות משוכפל עם חומרים מזינים אחרים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לצמיחה והתפתחות או תולעת, כדי לקבוע את השפעות טוקסיקולוגי של טיפולים תרופתיים. ההשפעות של ריכוזי heme מגוונים על הצמיחה של תולעים מסוג בר נקבעו באמצעות תצפית מיקרוסקופית איכותית ועל ידי quantitating tהוא מספר התולעים שגדלו בכל ריכוז heme. בנוסף, ההשפעה של ריכוזים תזונתיים מגוונים ניתן assayed ידי ניצול תולעים המבטאים חיישני ניאון שמגיבים לשינויים בתזונתיים של עניין. יתרה מזאת, מספר גדול של תולעים יוצרו בקלות עבור הדור של elegans המהונדס ג באמצעות הפגזת microparticle.
נמטודות הקרקע, elegans Caenorhabditis, הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במחקרים רבים מתחום הגנטיקה לטוקסיקולוגיה. כתוצאה מגודלו 1 מ"מ, זמן דור המהיר של ארבעה ימים, קל טיפוח, ומספרי צאצאים גדולים, נמטודות אלה כבר נוצלו במספר מסכי גנטיים תרופתיים 1, 2. חוקרים לנצל את תולעת זה כדי לזהות מולקולות ומסלולים נשמרים במערכות בעלי חוליות. מסלולים אלה כוללים אותות מוות של תאים, מסלולים של הזדקנות ואת חילוף חומרים, ואת מערכת העצבים 3-6. בנוסף, השקיפות של ג elegans מאפשר לדור של קווים מהונדסים באמצעות כתבי חלבון פלואורסצנטי, אשר ניתן דמיינו ישירות לנתח דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון.
במחקרים רבים נמטודות זה תרבית על משטח המבוסס על אגר מוצק באמצעות מדיום גידול נמטודות צלחות (NGM) או בליטרתרבויות iquid זרע עם Escherichia coli כמקור מזון 7,8. מקורות מזון של חיידקים אלה יכולים לבלבל את מחקרים ביוכימיים ורעלים עם הפרעות מחיידקי תוצרי המשפיעים על הפרשנות של תוצאות. על מנת להימנע מתופעות הרכבה אלה, ג יכול להיות מתורבת elegans בתקשורת נוזלית axenic כי הוא נטול חיידקים כמקור מזון. שימוש בתקשורת זו, אנו תרבית בהצלחה מיליוני תולעים מסונכרנים היטב עבור רבים ג הסטנדרטי פרוטוקולי elegans כולל ניתוח microarray של גנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי בג elegans נחשף לריכוזי heme שונים, וייצור של תולעים מהונדסים באמצעות הפגזת גן. מדיה זו הגדרה כימית ושונה ממתכון מקורי שגובש על ידי ד"ר אריק קלג 9. השימוש במדים mCeHR זה, זיהינו בהצלחה את הגנים מעורבים בהומאוסטזיס heme, המכונה גנים כheme מגיבים (HRG ים) 10, שהייתלא היה אפשרי בתנאי גידול רגילים אשר מנצלים צלחות אגר NGM seeded עם א ' coli.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההליך להחדרה ושמירה על ג elegans גדל על E. coli לmCeHR axenic ולנצל בשיטה זו כדי לקבל מספר גדול של תולעים לייצור ג המהונדס קווי elegans באמצעות הפגזת microparticle. אנחנו גם לימודים הנוכחיים המציגים את התועלת של שימוש במדים axenic לקביעת הדרישה התזונתית של ג elegans באמצעות heme לדוגמא ירושלים. מחקרים אלה מראים כי השימוש במדים mCeHR מאפשר צמיחה מהירה של מספר גדול של ג elegans עבור יישומים במורד הזרם רבים מנוצלים על ידי חוקרי תולעת.
בפרוטוקול זה אנו מציגים mCeHR הותאם axenic נוזל מדיה המאפשרת לג המהיר דור elegans עם ייצור של מספר רב של תולעים. מדיה זו מציגה מספר יתרונות כמו התולעים גדלים בלי לזהם E. coli או תוצרי לוואי וחיידקים יכול להיות מנוצלים במחקרים תזונתיים וטוקסיקולוגי. שימושו של ע '…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לHealthGrants DK85035 וDK074797 (IH).
MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
Thymine | Sigma | T0376 | |
N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
Biotin | Sigma | B-4639 | |
Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
Niacin | Sigma | N-0761 | |
Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
or | |||
Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |