संवर्धन<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em > Microparticle बमबारी से axenic तरल मीडिया और ट्रांसजेनिक कीड़े के निर्माण में
Summary
एलिगेंस आमतौर पर ठोस अगर प्लेट पर हो या तरल संस्कृतियों में ई. के साथ वरीयता प्राप्त है कोलाई. विषाक्तता और पोषक तत्वों की पढ़ाई confounding से बैक्टीरियल byproducts रोकने के लिए, हम बहाव के अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए कीड़े की एक बड़ी संख्या बढ़ने और सिंक्रनाइज़ करने के लिए, एक axenic तरल मध्यम, CeHR का उपयोग किया.
Abstract
इस प्रोटोकॉल में, हम आवश्यक सामग्री मौजूद है, और संशोधित सी बनाने के लिए प्रक्रिया. ई legans आदी होना और प्रजनन मीडिया (mCeHR). इसके अतिरिक्त, सी. उजागर और acclimatizing के लिए कदम ई. पर हो एलिगेंस तरल मीडिया axenic को कोली वर्णित हैं. Axenic सी. उपयोग है कि अंत में, बहाव के प्रयोगों एलिगेंस इस प्रक्रिया के लाभों को वर्णन. सी. विश्लेषण और निर्धारित करने की क्षमता एलिगेंस पोषक तत्वों की आवश्यकता बदलती हीम सांद्रता के साथ axenic तरल मीडिया में एन 2 जंगली प्रकार के कीड़े से बढ़ से यह साफ किया गया था. यह प्रक्रिया कीड़ा वृद्धि और विकास के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए या, दवा उपचार के जहर के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अन्य पोषक तत्वों के साथ दोहराया जा सकता है. जंगली प्रकार के कीड़े के विकास पर विभिन्न हीम सांद्रता का प्रभाव गुणात्मक सूक्ष्म अवलोकन के माध्यम से और टी quantitating द्वारा निर्धारित किया गया हैप्रत्येक हीम एकाग्रता में वृद्धि हुई है कि कीड़े की वह संख्या. इसके अलावा, विभिन्न पोषक सांद्रता का असर ब्याज के पोषक तत्वों में परिवर्तन का जवाब है कि फ्लोरोसेंट सेंसर व्यक्त कि कीड़े के उपयोग के द्वारा assayed किया जा सकता है. इसके अलावा, कीड़े की एक बड़ी संख्या में आसानी से microparticle बमबारी का उपयोग ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस की पीढ़ी के लिए तैयार किए गए.
Introduction
मिट्टी निमेटोड, Caenorhabditis एलिगेंस, विष विज्ञान को आनुवंशिकी से कई अध्ययनों में इस्तेमाल एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. अपने 1 मिमी आकार, चार दिन, खेती की आसानी के तेजी से पीढ़ी समय, और बड़ी संतान संख्या का एक परिणाम के रूप में, इन नेमाटोड आनुवंशिक और औषधीय स्क्रीन 1, 2 की एक संख्या में उपयोग किया गया है. शोधकर्ताओं हड्डीवाला प्रणाली में संरक्षित अणुओं और रास्ते की पहचान करने के लिए इस कीड़ा का लाभ ले. ये रास्ते कोशिका मृत्यु का संकेत है, उम्र बढ़ने और चयापचय के रास्ते, और तंत्रिका तंत्र 3-6 शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, सी. की पारदर्शिता एलिगेंस सीधे जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और प्रोटीन स्थानीयकरण का विश्लेषण करने की कल्पना की जा सकती है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन पत्रकारों, का उपयोग ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.
कई अध्ययनों में इस निमेटोड निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) प्लेट का उपयोग कर एक ठोस अगर आधारित सतह पर या एल में सुसंस्कृत हैiquid संस्कृतियों एक खाद्य स्रोत 7,8 के रूप में ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त. ये जीवाणु खाद्य स्रोतों द्वारा उत्पादों परिणामों की व्याख्या को प्रभावित करने वाले जीवाणु से हस्तक्षेप साथ जैव रासायनिक और विष विज्ञान के अध्ययन उलझाना कर सकते हैं. सी. इन जटिल प्रभाव से बचने के लिए एलिगेंस एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया से रहित है कि एक axenic तरल मीडिया में संवर्धित किया जा सकता है. इस मीडिया का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक कई मानक सी. के लिए अत्यधिक सिंक्रनाइज़ कीड़े के लाखों सुसंस्कृत सी. में विभिन्न विनियमित जीन की माइक्रोएरे विश्लेषण सहित एलिगेंस प्रोटोकॉल एलिगेंस अलग हीम सांद्रता के संपर्क में है, और जीन बमबारी का उपयोग ट्रांसजेनिक कीड़े का उत्पादन. यह मीडिया रासायनिक परिभाषित और डॉ. एरिक क्लेग 9 द्वारा तैयार एक मूल नुस्खा से संशोधित किया गया है. इस mCeHR मीडिया का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक हीम homeostasis में शामिल जीनों की पहचान की है, 10 (एचआरजी ओं) के रूप में हीम उत्तरदायी जीनों को भेजा, जो होगाई. के साथ वरीयता प्राप्त एन जी एम अगर प्लेटों का उपयोग, जो नियमित रूप से विकास की स्थिति में संभव नहीं किया गया है कोलाई.
इस प्रोटोकॉल में हम सी. शुरू करने और बनाए रखने के लिए प्रक्रिया का वर्णन ई. पर हो एलिगेंस कोली axenic mCeHR करने और ट्रांसजेनिक सी. के उत्पादन के लिए कीड़े की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए इस विधि का उपयोग microparticle बमबारी का उपयोग एलिगेंस लाइनों. सी. के पोषण की आवश्यकता का निर्धारण करने के लिए axenic मीडिया का उपयोग करने की उपयोगिता बताते हैं कि हम भी उपस्थित पढ़ाई एलिगेंस एक उदाहरण के रूप में हीम का उपयोग कर. इन अध्ययनों mCeHR मीडिया का उपयोग सी. की एक बड़ी संख्या का तेजी से विकास के लिए अनुमति देता है कि दिखाने कीड़ा शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एलिगेंस.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में हम तेजी से सी के लिए अनुमति देता है एक संशोधित axenic तरल मीडिया mCeHR पेश कीड़े की एक बड़ी संख्या के उत्पादन के साथ एलिगेंस पीढ़ी. कीड़े ई. contaminating के बिना हो रहे हैं यह मीडिया के कई फायद?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम HealthGrants DK85035 और DK074797 (एच) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Referências
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genética. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
