培養<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em >微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に
Summary
線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。
Abstract
このプロトコルでは、必要な材料を提示し、修正Cを製造するための手順。電子のlegans馴化培地および再生（mCeHR）。また、Cを露出し、順化のためのステップE.上に成長した虫液体培地を無菌にする大腸菌が記載されている。無菌Cを利用し、最終的に、下流の実験虫は、この手順の利点を示す。 Cを分析し、決定する能力虫の栄養要件は、ヘム濃度を変化させて無菌液体培地中の窒素野生型線虫を成長させることによって示された。この手順では、ワームの増殖および発達のための最適濃度を決定するために、または、薬剤治療の毒性効果を決定するために、他の栄養素を複製することができる。野生型線虫の成長に様々なヘム濃度の効果は、定性的な顕微鏡観察を経てTを定量することによって決定した各ヘム濃度に生えワームの彼は数。また、多様な栄養素の濃度の効果は、関心対象の栄養素の変化に応答する蛍光センサーを発現するワームを利用することによってアッセイすることができる。さらに、ワーム多数の容易に微粒子衝撃を用いて、トランスジェニックC.エレガンスの生成のために作製した。
Introduction
土壌線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）は 、遺伝学からの毒物学の多くの研究に使用される強力なモデル生物である。その1mmの大きさは、4日間の迅速な世代時間、培養の容易さ、および大子孫数の結果として、これらの線虫は、遺伝的および薬理学画面1、2の数で利用されている。研究者は、脊椎動物系において保存分子や経路を同定するために、このワームを利用しています。これらの経路は、細胞死シグナル、加齢や代謝経路、および神経系3-6が含まれています。また、Cの透明性エレガンス直接遺伝子発現パターンおよびタンパク質局在を分析するために可視化することができる蛍光タンパク質レポーターを用いて、トランスジェニック系統の生成を可能にする。
多くの研究では、この線虫線虫成長培地（NGM）プレートを用いて、固体寒天ベースの表面上またはlで培養されるiquid培養は、食料源7,8として大腸菌を播種。これらの細菌の食料源は副産物結果の解釈に影響を与える細菌からの干渉との生化学的および毒物学的研究を混乱することができます。これらの複合効果を回避するために、C.エレガンスは、食物源として細菌を欠いている無菌液体培地で培養することができる。このメディアを使用して、我々は成功し、多くの標準的なCには、高度に同期化されたワームの何百万人を培養しCの差別的に調節された遺伝子のマイクロアレイ解析などの虫プロトコル虫は異なるヘム濃度に暴露し、遺伝子衝撃を使用してトランスジェニックワームの生産。このメディアは、化学的に定義されており、博士エリッククレッグ9によって配合オリジナルレシピから変更されている。 10は 、ここであろう（HRG複数）のようなヘム応答性遺伝子と呼ばれるこのmCeHRメディアを使用して、我々は正常ヘム恒常性に関与する遺伝子を同定したE.を接種NGM寒天プレートを用いる標準的な増殖条件下で可能ではなかった大腸菌 。
このプロトコルでは、Cを導入し、維持するための手順を説明しますE.上に成長した虫無菌mCeHRに大腸菌およびトランスジェニックC.を製造するためのワームを大量に取得するには、この方法を利用して微粒子衝撃を使って虫ライン 。 Cの栄養所要量を決定するための無菌の媒体を使用することの有用性を示す、我々もまた、本研究でエレガンス例としてヘムを用いて。これらの研究は、mCeHR媒体を使用してC.多数の急速な成長を可能にすることを示してワームの研究者によって利用され、多くのダウンストリームアプリケーションのためのエレガンス 。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、急激な温度が可能に変更された無菌の液体メディアmCeHRを提示ワームは、多数の生産を生成エレガンス 。ワームは、Eを汚染することなく成長しているように、このメディアは、いくつかの利点を示しています大腸菌や細菌の副生成物及び栄養と毒性試験に利用することができます。 Eの使用このような研究において、大腸菌また?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、HealthGrants DK85035及びDK074797（IH）の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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