배양<em> 예쁜 꼬마 선충</em > 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에
Summary
C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.
Abstract
이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.
Introduction
토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다.
많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 많은 표준 C에 대한 높은 동기 웜의 수백만을 배양 C.에 차등 규제 유전자의 마이크로 어레이 분석을 포함한 엘레 프로토콜 엘레 다른 헴 농도에 노출, 및 유전자 폭격을 이용한 형질 전환 웜의 제작. 이 매체는 화학적으로 박사 에릭 클레 9 공식화 원래 레시피에서 수정됩니다. 이 mCeHR 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 헴 항상성에 관여하는 유전자를 발견했습니다, 10 (HRG의)와 같은 헴 반응 유전자를 언급하는 것E. 시드 NGM 한천 플레이트를 사용 정규 성장 조건에서 불가능했다 대장균.
이 프로토콜에서 우리는 C.를 도입하고 유지하기위한 절차를 설명 E. 성장 엘레 콜라이 무균 mCeHR 및 트랜스 제닉 C. 제조 웜의 다수를 구하는 방법이 활용 미세 충격을 사용하여 엘레 라인. C.의 영양 소요량을 결정하기위한 무균 매체 사용의 실용성을 보여 우리 또한 본 연구 엘레 예로 헴을 사용. 이러한 연구는 mCeHR 매체를 사용하여 C. 다수의 급속한 성장을 허용한다는 것을 보여 웜 연구자에 의해 사용 많은 다운 스트림 애플리케이션을위한 엘레.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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