Odling<em> Caenorhabditis elegans</em > I axenisk Liquid Media och Skapande av transgena maskarna från mikropartikelbombardemang
Summary
C. elegans är oftast odlas på fasta agarplattor eller i flytande kulturer ympats med E. coli. För att förhindra bakteriella biprodukter från confounding toxikologiska och näringsmässiga undersökningar, utnyttjade vi en axenisk flytande medium, CeHR, att växa och synkronisera ett stort antal maskar för en rad tillämpningar i efterföljande led.
Abstract
I detta protokoll, presenterar vi material som krävs, och förfarandet för att göra modifierat C. E legans tillvänjning och reproduktions media (mCeHR). Dessutom stegen för att exponera och acklimatisera C. elegans odlas på E. coli för att axenisk flytande medier beskrivs. Slutligen, nedströms experiment som utnyttjar axenisk C. elegans illustrera fördelarna med detta förfarande. Förmågan att analysera och bestämma C. elegans näringsbehov illustrerades av växande N2 vildtyp maskar i axeniska flytande medier med varierande heme koncentrationer. Denna procedur kan upprepas med andra näringsämnen för att bestämma den optimala koncentrationen för mask tillväxt och utveckling, eller, för att fastställa de toxikologiska effekterna av läkemedelsbehandlingar. Effekterna av varierande heme koncentrationer på tillväxten av vildtyp maskar bestämdes genom kvalitativ mikroskopisk observation och genom att kvantifiera tHan antal maskar som växte i varje hem-koncentration. Dessutom kan effekten av olika koncentrationer av näringsämnen analyseras genom utnyttjande av maskar som uttrycker fluorescerande sensorer som reagerar på förändringar i närings av intresse. Dessutom är ett stort antal maskar var lätt produceras för alstring av transgena C. elegans med användning av mikropartikelbombardemang.
Introduction
Jorden nematoden, Caenorhabditis elegans, är en kraftfull modell organism som används i ett flertal studier från genetik till toxikologi. Som ett resultat av dess 1 mm storlek, snabba generationstiden av fyra dagar, enkel odling, och stora avkommevirioner siffror har dessa nematoder utnyttjats i ett antal genetiska och farmakologiska skärmarna 1, 2. Forskarna utnyttjar denna mask för att identifiera molekyler och vägar bevarade i ryggradsdjur system. Dessa vägar innefattar celldödssignaler, vägar av åldrande och metabolism och nervsystemet 3-6. Dessutom insyn i C. elegans möjliggör generering av transgena linjer med användning av fluorescerande protein reportrar, som direkt kan visualiseras för att analysera genuttryck mönster och proteinlokalisering.
I många studier denna nematod odlas på ett fast agar-baserad ytan med nematod tillväxtmedium (NGM) plattor eller liquid kulturer seedade med Escherichia coli som en näringskälla 7,8. Dessa bakterie födokällor kan förbrylla biokemiska och toxikologiska studier med störningar från bakteriella biprodukter som påverkar tolkningen av resultaten. För att undvika dessa sammansatta effekterna, C. elegans kan odlas i en axeniska flytande media som saknar bakterier som en näringskälla. Med hjälp av detta medium, vi framgångsrikt odlas miljontals starkt synkroniserade maskar för många standard C. elegans protokoll inklusive microarray analys av differentiellt reglerade gener i C. elegans utsatta för olika heme koncentrationer, och produktion av transgena maskar som använder genen bombardemang. Detta media är kemiskt definierade och ändras från ett original recept formulerades av Dr Eric Clegg 9. Med hjälp av denna mCeHR media, har vi lyckats identifiera gener som är involverade i heme homeostas, kallas heme känsliga gener (HRG s) 10, vilket skullehar inte varit möjligt i vanliga tillväxtbetingelser, vilka utnyttjar NGM agarplattor ympade med E. coli.
I detta protokoll beskriver vi förfarandet för att införa och upprätthålla C. elegans odlas på E. coli till axenisk mCeHR och använda denna metod för att erhålla ett stort antal maskar för att producera transgena C. elegans linjer med mikropartikelbombardemang. Vi presenterar också studier som visar nyttan av att använda axeniska medier för att bestämma näringsmässiga krav på C. elegans med hjälp av heme som exempel. Dessa studier visar att användning av mCeHR media möjliggör snabb tillväxt av ett stort antal C. elegans för många nedströms applikationer som används av snäck forskare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll presenterar vi en modifierad axenisk flytande media mCeHR som möjliggör snabb C. elegans generation med produktionen av ett stort antal maskar. Detta media visar flera fördelar eftersom maskarna odlas utan att förorena E. coli eller bakteriella biprodukter och kan utnyttjas i näringsmässiga och toxikologiska studier. Användningen av E. coli eller andra bakterier i sådana studier har flera nackdelar. Till exempel, kan tillväxten av bakterier förändras under olika f?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of HealthGrants DK85035 och DK074797 (IH).
Materials
| MgCl2.6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate.H2O | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2.2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2.4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2.2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2 – and3 -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine.2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine.HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine.HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, Na salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
Referências
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genética. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
