Nós apresentamos um biochip electroquímica à base de microfluidos para a detecção de hibridação de ADN. Após a funcionalização ADNcs sonda, a especificidade, a sensibilidade, e o limite de detecção são estudadas com alvos de ADNcs complementares e não complementares. Os resultados ilustram a influência dos eventos de hibridação de ADN no sistema electroquimico, com um limite de detecção de 3,8 nM.
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Artigo de método
A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label
Neste artigo
Resumo
Resumo
A miniaturização de procedimentos analíticos de bancada para a micro-escala fornece vantagens significativas em relação ao tempo de reacção, o custo, e a integração dos passos de pré-processamento. Utilizando estes dispositivos para a análise de eventos de hibridação de ADN é importante porque oferece uma tecnologia para a avaliação em tempo real dos marcadores no ponto de atendimento para várias doenças. No entanto, quando a pegada dispositivo diminui o domínio de vários aumentos de fenômenos físicos. Estes fenómenos influenciar a precisão de fabrico e a fiabilidade de operação do dispositivo. Portanto, há uma grande necessidade de fabricar e operar com precisão estes dispositivos de uma maneira reprodutível, a fim de melhorar o desempenho global. Aqui, descrevemos os protocolos e os métodos utilizados para a fabricação e operação de um biochip eletroquímica microfluídica à base para a análise precisa de eventos de hibridização DNA. O biochip é composto por duas partes: um chip de microfluidos comtrês micro-canais paralelos feitos de polidimetilsiloxano (PDMS), e um 3 x 3 dispostas electroquímica de micro-chip. Os eventos de hibridização DNA são detectados através da análise de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). A análise EIS permite variações de monitoramento das propriedades do sistema eletroquímico que são dominantes nessas escalas de comprimento. Com a capacidade de monitorar as alterações de ambos e de transferência de carga com a resistência à difusão do biossensor, que demonstram a selectividade para alvos de ADNcs complementares, calculado um limite de detecção de 3,8 nM, e uma reactividade cruzada de 13% com outro ADNcs não complementar a seguir 20 min de incubação. Esta metodologia pode melhorar o desempenho dos dispositivos miniaturizados por elucidar sobre o comportamento de difusão no regime de micro-escala e por permitir o estudo de eventos de hibridação de ADN.
Introdução
Lab-on-a-chip dispositivos microfluídicos (LOC) oferecem inúmeras vantagens em diagnósticos clínicos, monitoramento ambiental e pesquisa biomédica. Estes dispositivos utilizam canais de microfluidos para controlar o fluxo do fluido às regiões do chip em que uma variedade de processos pode ocorrer incluindo a mistura de reagente, a afinidade de ligação com base, a transdução de sinal, e a cultura de células 1-4. Microfluídica oferece muitas vantagens sobre as ferramentas de diagnóstico clínicos convencionais, tais como leitores de microplaca ou eletroforéticos testes de desvio de gel. Dispositivos de microfluidos requerem 2 a 3 ordens de magnitude (em oposi....
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Protocolo
1. Microfabricação do chip microfluídico
- Prepare Eletroquímica Chip
- Padrão Ouro Eletrodos
- Lavar a 4 'wafer de silício em branco (qualidade prime) com acetona, metanol e isopropanol ("AMI" limpo). Lavar o isopropanol a partir da bolacha com água desionizada (DI), seguida por secagem com N2 arma.
- Crescer uma espessa camada de SiO2 passivation 1 mícron com deposição química a vapor assistida por plasma (PECVD) ferramenta. Deposite um 200 uma espessa camada de cromo seguido por um 2000 uma espessa camada de ouro com uma ferramenta de sputtering DC.
- Girar "PR1" fotossensíveis positivas (parâmetros ....
- Padrão Ouro Eletrodos
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Resultados
Um processo de fabricação controlado e preciso para o dispositivo experimental é essencial para a investigação. Ela permite ao pesquisador obter experimentos reprodutíveis rendimento e alta. Aqui demonstramos um rendimento elevado, o processo de microfabricação alta reprodutibilidade de um biochip electroquímica microfluidos-base (Figura 1). Com uma taxa de falha baixa, alguns dispositivos têm mostrado problemas de ligação que conduzem a fugas de solução. De modo a validar a actividade electroquímica do.......
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Discussão
Nossos procedimentos demonstram a fabricação de um biochip eletroquímico baseado em microfluídica e sua utilização para a análise de eventos de hibridização DNA. Através de um processo de alto rendimento microfabricação controlada desenvolvemos um dispositivo composto por canais em microescala integrados com uma matriz de transdutores electroquímicos. Nós planejamos parâmetros de processamento controlados para o procedimento de fotolitografia do chip eletroquímica eo molde canal microfluídicos através de uma abordagem i.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o Robert W. Deutsch Foundation, a Agência de Redução de Ameaças à Defesa (DTRA) ea National Science Foundation Emerging Frontiers in Investigação e Inovação (EFRI) pelo apoio financeiro. Os autores também agradecem a NanoCenter Maryland e sua Fablab para suporte instalação de sala limpa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4'' Bolacha de silício | Ultrasil | 4-5664 | Único lado polido; Tipo P; Dopado com boro; Orientação 1-0-0; Espessura 500 mícrons; Resistência 10-20 ohm· cm |
| Shipley 1813 fotorresistente ("PR1") | Microchem | positivo fotorresistente | |
| AZ5214 fotorresistente ("PR2") | Hoechst Celanse | fotorresistente positivo | |
| SU-8 50 fotorresistente ("PR3") | Microchem | negativo fotorresistente | |
| Corrosão de ouro | Transeno | TFA | Sem diluição |
| Corrosão de cromo | Transene | 1020AC | Sem diluição |
| PDMS elastômero | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| Agente de cura PDMS | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Ferramenta de perfuração para biópsia | Healthlink | BP20 | |
| Tygon tubo flexível | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon adaptador flexível | Cole Parmer | 06417-41 | seringa de 0,0625" |
| 1 ml | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Fluka | 1551139 | |
| Fosfato de potássio dibásico anidro | Sigma | RES20765-A7 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxietil)fosfina | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrado tampão de citrato de sódio-solução salina | Sigma | 93017 | |
| Hexacianoferrato de potássio (III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA # 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3' |
| Alvo ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3' |
| Tecnologias Integradas | DNA (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3' |
| Alvo ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3' |
| Tecnologias Integradas de | DNA (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3' |
| Instrumento | |||
| Deposição de Vapor Químico Aprimorada por Plasma (PECVD) | Sistema | PlasmaLab da Oxford Instruments 100 | Pressão da câmara 1.000 mTorr, Temperatura 200 ° C, potência de RF 20 W, Gases: a) Vazão N2O 710 sccm; b) uma composição de 5% de SiH4 e 95% de vazão de gases N2 170 sccm, taxa de crescimento de SiO2 690 Å/min. |
| Unidade de pulverização catódica CC | AJA International | ATC 1800-V | Para cromo: Pressão da câmara 10 mTorr, vazão de argônio 20 sccm, alimentação CC fornecida 200 W, taxa de pulverização catódica 10 nm/min. Para ouro: Pressão da câmara 10 mTorr, vazão de argônio 20 sccm, alimentação CC fornecida 200 W, taxa de pulverização 36 nm/min. |
| Sistema de evaporação E-beam | Denton | Construído sob medida | para titânio: Pressão da câmara < 2 x 10-6 Torr, Potência fornecida para o e-gun 7,5 kW, Corrente do filamento 150-200 mA, Taxa de evaporação 6-10 Å/seg. Para Platina: Pressão da câmara < 2 x 10-6 Torr, Potência fornecida para a e-gun 7,5 kW, Corrente do filamento 150-200 mA, Taxa de evaporação 2-3 Å/seg. |
| Potenciostato | CH Instruments | 660D | |
| Bomba de seringa | KD Scientific | KDS230 |
Referências
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
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Reimpressões e permissões
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