Bedöma Sekretorisk Kapacitet på bukspottskörteln acinarceller

Summary

Isolerade pankreas acini behåller sin in vivo morfologi och aktivitet och erbjuder kraftfulla sätt för att övervaka och manipulera utsöndring. Detta arbete visar hur acini kan isoleras från mus bukspottkörteln, och hur deras sekretoriska kapacitet kan bedömas.

Abstract

Bukspottkörtel acinarceller producerar och utsöndrar matsmältningsenzymer. Dessa celler är organiserade som ett kluster som bildar och delar en gemensam lumen. Detta arbete visar hur den sekretoriska kapaciteten av dessa celler kan bedömas genom odling av isolerade acini. Installationen är fördelaktigt eftersom isolerat acini, som behåller många egenskaper intakta exokrin pankreas kan manipuleras och övervakas lättare än i hela djuret. Korrekt isolering av pankreasacini är ett nyckelkrav, så att ex vivo kultur kommer att representera vilken typ av acini in vivo. Protokollet visar hur du isolera intakt acini från musen bukspottkörteln. Därefter två kompletterande metoder för att utvärdera pankreassekre presenteras. Den amylas sekre analysen fungerar som en global åtgärd, medan direkt avbildning av pankreassekre möjliggör karakterisering av sekre vid en sub-cellulär upplösning. Kollektivt ger de tekniker presented här möjliggör ett brett spektrum av experiment för att studera exokrin sekretion.

Introduction

Den exokrina bukspottkörteln utgör det mesta av massan av däggdjurs pankreas och är dedikerad till produktion och utsöndring av matsmältningsenzymer ^1. Den funktionella enhet av exokrin pankreas, den acinus är ett kluster av epitelceller som bildar och delar en gemensam lumen. Vid hormonell eller neuronal stimulering är blåsor fyllda med enzymer transporteras till apikala cellytan, säkring med den och utvisa innehållet i lumen ^1-3. De utsöndrade enzymer sedan rinna av en sammanslagnings uppsättning ledningar till tunntarmen, där de katalyserar nedbrytningen av maten till näringsämnen.

Denna video visar hur intakt acini isoleras från hela bukspottkörteln och hur deras sekretoriska kapacitet kan bedömas. Med hjälp av denna inställning är pankreassekre kvantifieras genom att mäta den relativa mängden av amylas som släpptes efter stimulering. Alternativt kan sekre avbildas levande med hjälp av olikasensorer och färgämnen.

Den ex vivo installationen av bukspottskörteln acini är fördelaktigt eftersom isolerat acini, som behåller många egenskaper intakta bukspottkörteln, kan manipuleras och övervakas lättare än i hela djuret ^4-6. Denna inställning utvecklades ursprungligen i slutet av 1970-talet och var sedan förlängdes för att studera flera exokrina vävnader såsom spott och bröstkörtlar ^3-7. Särskilt tillåter studiet av sekre med minimal störning av de komplexa cellulära organisationerna i dessa polariserade epitel.

Protocol

OBS: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Weizmann Institute of Science. 1 Provberedning Isolering av pankreasacini Bered 300 ml färsk Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) medium innan du startar. Blanda 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glukos, 10 mM HEPES. Lägg bovint serumalbumin (BSA) och 0,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor (STI) (resuspens…

Representative Results

Bukspottkörtel acini som var isolerade korrekt visa ett stereotypt morfologi när den betraktas i genomlysning. Deras basolaterala domäner ska visas runt och saknar blebs. Den apikala domänen är omgiven av hundratals sekretoriska vesiklar och verkar mörkare i färgen (figur 2A, B). Kärnorna ligger basal till vesikulär området. Cell skräp och komponenter i bukspottskörteln duktal systemet och i det endokrina bukspottkörteln, som kan detekteras vid tidiga stadier av acini isolering (Fig…

Discussion

Förutom den ex vivo kultur, alternativa uppställningar för studiet av exokrin sekretion inkluderar intravital mikroskopi och mätning av fluider från den pankreatiska gången. Intravital mikroskopi visade sig fungera väl i musen spottkörtlarna ^10. Denna metod kan spela utsöndring i realtid i det intakta djuret, men är begränsad i dess upplösning och genom anordningen för att manipulera den exokrina vävnaden. Bedöma utsöndring genom att samla vätskor från bukspottkörtelgången uppnåd…

Materials

ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808