In Vivo L'électroporation et microinjection de testicule de souris

Summary

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

Abstract

Cette vidéo et l'article contribution donne une description complète de micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo. Cette technique de transfection particulier pour les cellules testiculaires de souris permet l'étude des processus uniques de la spermatogenèse.

Le protocole qui suit se concentre sur la transfection de cellules testiculaires de souris avec des constructions plasmidiques. Plus précisément, nous avons utilisé le vecteur rapporteur pEGFP-C1, qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) et aussi le vecteur pDsRed2-N1 exprimant la protéine fluorescente rouge (DsRed2). Les deux gènes rapporteurs codés étaient sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain précoce immédiat (CMV).

Pour effectuer un transfert de gène dans les testicules de souris, les constructions de plasmides rapporteur sont injectés dans les testicules de souris vivantes. À cette fin, les testicules d'un animal anesthésié est exposé et le site de micro-injection est préparée. Notre lieu privilégié deinjection est conduit efférent, avec le rete testis finalement connecté en tant que voie de transport anatomique des spermatozoïdes entre le testicule et l'épididyme. De cette manière, le remplissage des tubes séminifères après la micro-injection est très bien gérée et contrôlée grâce à l'utilisation de solutions d'ADN colorées. Après avoir observé un remplissage suffisant du testicule par sa structure de tube de couleur, l'organe est soumis à une électroporation. Ceci permet le transfert de la solution d'ADN dans les cellules testiculaires. À la suite de 3 jours d'incubation, le testicule est enlevé et étudiée au microscope à fluorescence verte ou rouge, ce qui illustre le succès de la transfection.

Généralement, ce protocole peut être utilisé pour fournir l'ADN ou l'ARN construit dans les testicules de souris vivante pour (sur) exprimer ou abattre des gènes, ce qui facilite l'analyse de la fonction des gènes in vivo. En outre, il est adapté pour l'étude de constructions rapporteurs ou règlements de gène putatiféléments conservateurs. Ainsi, les principaux avantages de la technique d'électroporation sont des performances rapides en combinaison avec peu d'effort ainsi que l'équipement technique modérée et les compétences requises par rapport à d'autres techniques.

Introduction

Spermatogenèse chez les mammifères est considérée comme un processus complexe de cellules souches auto-renouvelables subissant successivement la mitose, la méiose et de la différenciation, afin de développer dans les spermatozoïdes matures haploïde. Ces changements morphologiques sont orchestrées par différents types de cellules et malgré les tentatives profondes, il est encore impossible d'imiter ces procédés en culture cellulaire ^1,2. Par conséquent, la recherche sur la spermatogenèse jusqu'à maintenant s'appuie sur les organismes vivants comme des modèles in vivo. En général, les études de la fonction des gènes sont généralement basées sur les animaux transgéniques. Toutefois, la génération et le maintien de ce type de modèle animal est long, coûteux et très élaboré. Ceci est attribué au processus de sélection de temps nécessaire pour générer et maintenir le transgène au cours des générations. En outre, la manipulation génétique de l'organisme tout entier par l'approche transgénique ou knock-out est sujette à provoquer des déficiences physiologiques lors du ciblage gènes avec des fonctions essentielles dans plusieurs régions, par exemple, en dehors du testicule ou systémique.

En outre, certaines méthodes de transfection transitoire sont associés à des inconvénients cruciaux. Par exemple, les inconvénients typiques de transfert de gène à médiation virale sont la provocation possible de réactions immunologiques et des règlements de sécurité supplémentaires, tandis que la lipofection ³ et ⁴ bombardement de microparticules peut endommager les tissus et sont limités à une certaine profondeur de la cellule pour l'efficacité de la transfection suffisante.

En revanche, l'électroporation (EP) comme une autre façon commune de transfection transitoire, semble constituer une technique prometteuse pour permettre à la transfection in vivo et in vivo une analyse cohérente de gène. En général, les PE est désigné comme un phénomène dynamique qui dépend de la tension transmembranaire locale avec des pores au sein médiées par conséquent nanosecondes. Ces écarts peuvent être maintenus pendant millisecondes, suffisant to accorder l'accès à l'ADN, de l'ARN ou des petites molécules ^5. Lorsque la tension appliquée est trop élevée, le caractère généralement transitoire de PE est compensée en raison de la production de chaleur et de perméabilisation induction trop étendu avec en conséquence des dommages irréversibles de la cellule ^5.

Ici, nous montrons que l'électroporation est un système de transfection efficace et économique, qui est capable d'être utilisé pour la transformation génétique du testicule afin d'élucider les caractéristiques de gène in vivo sur les testicules. Cet article traite de la préparation de plasmides, la micro-injection par le conduit efférent et l'électroporation ultérieure de testicule de souris. Cette procédure peut être le moyen de choix pour atteindre transfection rapide, spécifique et efficace des tubes séminifères des testicules de souris in vivo afin d'étudier les processus de la spermatogenèse.

Protocol

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Allemagne). Préparation 1 Le plasmide Pour la préparation de plasmides, en utilisant des kits de purification de plasmide (voir le tableau des matériaux) ou des procédés similaires avec du tampon d'élimination de l'endotoxine de sorte que les réactions immunitaires d…

Representative Results

Le cadre expérimental pour réaliser une micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo tel qu'il est utilisé selon le protocole est illustré à la figure 1. Même si il est possible d'acquérir micropipettes fabriqués industriellement, nous avons préféré pour générer nos propres pipettes en tirant (figure 1A ) et le biseautage (figure 1B) des capillaires en verre de sorte que qu'ils équipés nos besoin…

Discussion

La recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction, en particulier dans le domaine de la fertilité masculine et la spermatogenèse inévitablement s'appuie sur les organismes vivants. Afin d'examiner la fonction testiculaire, pas de système de culture cellulaire adéquate / in vitro a été mis en place capable de réfléchir tous les essentiels des changements morphologiques d'un spermatogonies diploïdes à un ^1,2 spermatozoïde haploïde maturité. Ainsi,…

Materials

centrifuge	Sigma	1-15 PK
spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
micromanipulator	homemade		XYZ cross table
surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
surgical suture	Catgut 00	Catgut Markenkirchen
syringe, with 30G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10x PBS, pH 7.4	Carl Roth	3957.1	NaCl [1.37 M]
6781.1	KCl [27 mM]
T106.2	Na2HPO4+2H2O [100 mM]
3904.1	KH2PO4 [18 mM]
10% Ketamin	Serum Werk Bernburg	Urotamin	mix in a rate 1:1
2% Xylazin	Serum Werk Bernburg	Xylazin
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
vet ointment	S&K Pharma GmbH	Kerato Biciron 5% Augensalbe	or similar to prevent dryness of eyes
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605