In vivo micro-injectie en elektroporatie of Mouse Testikel
Summary
Dit artikel beschrijft micro-injectie en elektroporatie van muis testis in vivo als een transfectie techniek voor testiculaire muizencellen unieke processen spermatogenese bestuderen. Het gepresenteerde protocol omvat stappen van glazen capillaire preparaat, micro-injectie via de efferente kanaal en transfectie door elektroporatie.
Abstract
Deze video en het artikel bijdrage geeft een uitgebreide beschrijving van de micro-injectie en elektroporatie van de muis testis in vivo. Deze bijzondere techniek voor transfectie testiculaire muizencellen maakt de studie van unieke processen in spermatogenese.
Het volgende protocol is gericht op transfectie van testiculaire muizencellen met plasmide constructen. Specifiek, gebruikten we de reporter vector pEGFP-C1, bevat immers versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) en de vector pDsRed2-N1 expressie rood fluorescerend eiwit (DsRed2). Beide gecodeerde reporter genen onder de controle van de humane cytomegalovirus onmiddellijke vroege promoter (CMV).
Voor het uitvoeren van gen-overdracht in de muis testes, wordt de verslaggever plasmideconstructen geïnjecteerd in testes van levende muizen. Daartoe wordt de testis van een verdoofd dier blootgesteld en de plaats van micro-injectie wordt bereid. Onze favoriete plek vaninjectie is de afvoerende buis, met het uiteindelijk verbonden testis als de anatomische transportroute van de spermatozoa tussen de testis en de bijbal. Op deze wijze wordt het vullen van de testes na micro-injectie uitstekend geleide en gecontroleerd door het gebruik van gekleurde DNA oplossingen. Na het observeren van een voldoende vulling van de testis door zijn gekleurde tubulus structuur, wordt het orgel geëlectroporeerd. Dit maakt de overdracht van de DNA-oplossing in de zaadcellen. Na 3 dagen incubatie, wordt de testis verwijderd en onderzocht onder de microscoop voor groene of rode fluorescentie, illustreren transfectie succes.
In het algemeen, kan dit protocol worden gebruikt voor het leveren van DNA-of RNA-constructen in levende muis testis om (over) te uiten of knock down genen, het vergemakkelijken van in vivo gen-functie analyse. Bovendien is het geschikt voor het bestuderen reporter constructen of vermoedelijke gen regulatory elementen. Aldus, de belangrijkste voordelen van de electroporatietechniek zijn snelle prestaties in combinatie met ultralichte en de gematigde technische uitrusting en vaardigheden vergelijking met alternatieve technieken.
Introduction
Zoogdieren spermatogenese wordt beschouwd als een geavanceerd proces van zelf-vernieuwing stamcellen achtereenvolgens ondergaat mitose, meiose en differentiatie om zich te ontwikkelen tot volgroeide haploïde spermatozoa zijn. Deze morfologische veranderingen beraamd door verschillende celtypen en ondanks diepe pogingen, is het nog steeds onmogelijk om deze processen bootsen in celkweek 1,2. Vandaar onderzoek spermatogenese tot nu berust op levende organismen in vivo modellen. In het algemeen worden genfunctie studies gewoonlijk gebaseerd op transgene dieren. Het genereren en behouden dergelijke diermodel is tijdrovend, kostbare en zeer uitgebreid. Dit wordt toegeschreven aan de vereiste lange veredelingsproces voor het genereren en onderhouden van het transgen via generaties. Bovendien, de genetische manipulatie van het gehele organisme door de transgene of knockout benadering gevoelig voor fysiologische stoornissen veroorzaken bij het targeten genes met essentiële functies in meerdere regio's, bijvoorbeeld, buiten de testis of systemisch.
Verder worden sommige transiënte transfectie methoden geassocieerd met een aantal belangrijke nadelen. Bijvoorbeeld, typische nadelen van virus gemedieerde gentransfer mogelijke provocatie van immuunreacties en aanvullende veiligheidsvoorschriften, terwijl lipofectie 3 en microdeeltjes bombardement 4 het weefsel kunnen beschadigen en zijn beperkt tot een bepaalde cel diepte voldoende transfectie efficiency.
Daarentegen, elektroporatie (EP) als een andere gebruikelijke manier transiënte transfectie, lijkt een veelbelovende techniek vormt voor het mogelijk in vivo transfectie en consistent in vivo gen analyse. In het algemeen wordt EP aangeduid als een dynamisch verschijnsel dat afhankelijk van de lokale transmembraan spanning met enerzijds gemedieerde poriën in nanoseconden. Deze hiaten kunnen worden gehandhaafd voor milliseconden, voldoende to toegang tot DNA, RNA of kleine moleculen 5 toe te kennen. Wanneer de aangelegde spanning te hoog is, wordt het gewoonlijk van voorbijgaande aard van EP tegengegaan door warmte en inductie van te veelomvattend permeabilisatie met daaruit onomkeerbare beschadiging van de cel 5.
Hier laten we zien dat elektroporatie is een effectieve en economische transfectie systeem dat kan worden gebruikt voor genetische transformatie testis om testicular gen kenmerken ontrafelen in vivo. Dit artikel behandelt plasmidepreparaat, micro-injectie via de efferente leiding en de daaropvolgende elektroporatie van muis testis. Deze procedure kan het middel van keuze snel, specifieke en efficiënte transfectie van testes van muis testis in vivo bereiken om processen te onderzoeken spermatogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoek op het gebied van reproductieve biologie, met name op het gebied van mannelijke vruchtbaarheid en spermatogenese onvermijdelijk gebaseerd op levende organismen. Om te functioneren van de testikels te onderzoeken, heeft geen adequate celcultuur / in vitro systeem opgezet in staat te reflecteren alle cruciale morfologische veranderingen van een diploïde spermatogonium een haploïde volwassen zaadcel 1,2. Aldus, het genereren van genetisch gemodificeerde dieren vaak noodzakel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Birgit Westernstroeer van het Centrum voor Reproductieve Geneeskunde en andrologie aan de Universiteit van Münster voor het onderwijzen van de testis micro-injectie. Trouwens, we zijn dankbaar Ursula Antkewitz en Petra Reckling voor technische ondersteuning. Wij danken de Duitse Research Foundation (DFG) voor de ondersteuning van dit werk (WE2458 / 10-1).
Materials
|
centrifuge |
Sigma | 1-15 PK | |
| spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder |
|
| fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| surgical suture | Catgut 00 | Catgut Markenkirchen |
|
| syringe, with 30G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10x PBS, pH 7.4 | Carl Roth | 3957.1 | NaCl [1.37 M] |
| 6781.1 | KCl [27 mM] | ||
| T106.2 | Na2HPO4+2H2O [100 mM] | ||
| 3904.1 | KH2PO4 [18 mM] | ||
| 10% Ketamin | Serum Werk Bernburg |
Urotamin | mix in a rate 1:1 |
| 2% Xylazin | Serum Werk Bernburg |
Xylazin | |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| vet ointment | S&K Pharma GmbH |
Kerato Biciron 5% Augensalbe |
or similar to prevent dryness of eyes |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 |
Referências
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
