Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH
Summary
Voies de réparation d'ADN sont essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique par l'observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d'ADN télomérique dans.
Abstract
Réparation de l'ADN défectueux entraîne une augmentation de l'instabilité génomique, ce qui est la cause de mutations qui conduisent à la tumorigenèse. L'analyse de la fréquence et le type d'aberrations chromosomiques dans des types cellulaires différents permet défauts dans les voies de réparation d'ADN à être élucidés. Compréhension des mammifères réparation de l'ADN en biologie a été grandement aidé par la production de souris avec des coups de grâce dans les gènes spécifiques. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique dans les lymphocytes B de souris. Étiquetage des télomères en utilisant des sondes PNA-FISH (acide nucléique peptidique – hybridation fluorescente in situ) facilite l'analyse rapide de l'instabilité génomique des spreads métaphase chromosomiques. Les cellules B ont des avantages spécifiques par rapport à des fibroblastes, car ils ont une ploïdie normale et un indice mitotique élevé. Culture à court terme des cellules B permet donc une mesure précise de l'instabilité génomique dans une population de cellules primaires qui est susceptible d'avoir moins mutation génétique secondaires que ce que l'on trouve généralement dans les fibroblastes transformés ou des lignées cellulaires de patients.
Introduction
Le cancer est causé par l'accumulation de mutations affectant les gènes qui régulent la croissance cellulaire normale. Mutation est une conséquence de changements dans la structure et la séquence du génome causée par des dommages à l'ADN. lésions de l'ADN peut se faire par une variété de processus, y compris des agents exogènes tels que des rayonnements ionisants, et en tant que sous-produit du métabolisme cellulaire normal, comme la désamination spontanée de bases nucléotidiques ou des dommages survenus par contact avec des espèces réactives de l'oxygène 1.
Bien que les cellules de mammifères possèdent une gamme d'activités de réparation qui peuvent inverser les dommages de l'ADN ou de rétablir l'ordre sur les sites de coupure, les mutations s'accumulent néanmoins tout au long de la durée de vie d'une cellule. dommage de l'ADN peut en outre contribuer à la sénescence et la perte d'activité de cellules souches, deux processus qui sont associées à la maladie de vieillissement associée à deux. Comprendre la réparation des lésions de l'ADN est donc d'une importance capitale dans la lutte contre deux signequestions ificant en matière de santé publique. Plus de preuves suggère que les mammifères voies de réparation d'ADN peuvent contribuer à l'évolution du génome des cellules cancéreuses 3,4, ce qui rend encore plus impératif de comprendre les processus impliqués dans la répression de mutation au niveau moléculaire.
La visualisation directe des aberrations chromosomiques est un moyen puissant et quantitatifs de déterminer l'étendue de l'instabilité génomique dans un type cellulaire particulier. Chromosomes condensés à partir de cellules en métaphase peuvent être isolés et contrôlés en utilisant la microscopie à fluorescence ou la lumière. Ces approches cytogénétiques ont été dans la pratique depuis plusieurs décennies et peuvent être utilisés pour démontrer l'apparition des translocations spécifiques ou les types d'aberrations chromosomiques associées à la perte des activités de réparation d'ADN. Le protocole se prête à plusieurs extensions potentielles: les chromosomes peuvent être marquées avec des sondes pour caryotype spectral (SKY) ou multicolore fluorescent hybridation in situ(MFISH) pour identifier des translocations 5,6. Ces techniques permettent également la fréquence des translocations chromosomiques et la structure de translocations chromosomiques complexes à déterminer, qui fournit des informations supplémentaires au-delà de ce qui est possible avec ce protocole. En variante, des sondes spécifiques des séquences peuvent être produites et utilisées pour tester la fréquence de cassure de l'ADN génomique dans les sites sélectionnés 7.
Dans ce protocole, nous décrivons la préparation du chromosome métaphasique se propage à partir de lymphocytes B. Un acide nucléique peptidique (PNA) sonde marquée par fluorescence pour des répétitions télomériques est utilisé, qui marque de manière efficace les télomères se propage chromosome en métaphase Ce protocole présente plusieurs avantages. Les cellules B peuvent être amenés à se développer à l'index mitotique élevé de sorte que les écarts de haute qualité peuvent toujours être produites. Cellules B de souris génétiquement modifiées sont aussi beaucoup moins susceptibles de contenir des mutations génétiques secondaires qui peuvent fausser l'analyse de la contributionde gènes spécifiques à l'intégrité du génome. L'approche PNA-FISH peut être complété en une seule journée, et permet notation plus précise des cassures chromosomiques. En utilisant cette approche, en particulier en combinaison avec des équipements spécifiques décrites dans ce protocole, il est possible de produire de très cohérentes, les écarts de haute qualité et d'analyser rapidement le taux et le type d'instabilité génomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que les lymphocytes B activés sont particulièrement adaptés à la préparation des étalements de chromosomes mitotiques, d'autres types de cellules peuvent également être utilisés. Lymphocytes T part un grand nombre des avantages de cellules B, comme elles peuvent être purifiées à partir de ganglions lymphatiques ou de la rate, et ont un indice mitotique élevé lorsqu'ils sont stimulés par la croissance dans un milieu contenant des mitogenes appropriés 8. Les cellules souches embryo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le NIH subvention R00 CA160574 (SFB) et par une bourse du Programme de formation en biotechnologie Rutgers (à SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
Referências
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