Vescica muscolo liscio Striscia contrattilità come un metodo per valutare Lower Urinary Tract Farmacologia
Summary
Questo manoscritto presenta una semplice, ma potente, metodo in vitro per valutare la contrattilità della muscolatura liscia in risposta ad agenti farmacologici o la stimolazione del nervo. Le applicazioni principali sono lo screening di stupefacenti e la fisiologia dei tessuti comprensione, farmacologia e patologia.
Abstract
Descriviamo un metodo in vitro per misurare vescica contrattilità della muscolatura liscia, e il suo uso per indagare le proprietà fisiologiche e farmacologiche della muscolatura liscia così come i cambiamenti indotti dalla patologia. Questo metodo fornisce informazioni fondamentali per comprendere la funzione della vescica, mentre superando notevoli difficoltà metodologiche incontrate in vivo, come ad esempio le manipolazioni chirurgiche e farmacologiche che influenzano la stabilità e la sopravvivenza dei preparativi, l'uso di tessuti umani, e / o l'uso di prodotti chimici costosi. Esso fornisce anche un modo per indagare le proprietà di ogni componente della vescica (cioè muscolatura liscia, mucosa, nervi) in condizioni sane e patologiche.
La vescica urinaria è rimosso da un animale anestetizzato, posto in soluzione di Krebs e tagliato a listarelle. Le strisce sono posti in una camera riempita con soluzione calda di Krebs. Una estremità è collegata ad un tensioattivo isometrican trasduttore per misurare la forza di contrazione, l'altra estremità è collegata ad una canna fissa. Tissue è stimolata da aggiungere direttamente composti al bagno o da elettrodi di stimolazione di campo elettrico che attivano i nervi, simile a innescare le contrazioni della vescica in vivo. Dimostriamo l'uso di questo metodo per valutare la contrattilità della muscolatura liscia spontanea durante lo sviluppo e dopo una lesione del midollo spinale sperimentale, la natura della neurotrasmissione (trasmettitori e recettori coinvolti), fattori coinvolti nella modulazione dell'attività della muscolatura liscia, il ruolo dei componenti della vescica individuali, e le specie e le differenze di organi in risposta ad agenti farmacologici. Inoltre, potrebbe essere utilizzata per indagare meccanismi intracellulari coinvolti nella contrazione e / o rilassamento della muscolatura liscia, droga relazioni struttura-attività e la valutazione di rilascio del trasmettitore.
Il metodo di contrattilità della muscolatura liscia in vitro è stato ampiamente utilizzato for più di 50 anni, e ha fornito dati che hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della funzione della vescica, nonché allo sviluppo farmaceutico di composti attualmente utilizzati clinicamente per la gestione della vescica.
Introduction
La muscolatura liscia della vescica si rilassa per permettere il riempimento di urina, e contratti di suscitare l'eliminazione delle urine. Il relax è mediata da proprietà intrinseche della muscolatura liscia e tonica rilascio di noradrenalina (NE) dai nervi simpatici, che attiva i recettori adrenergici beta (β 3 AR in umana) nel detrusore. Svuotamento si ottiene inibendo l'ingresso simpatico e l'attivazione dei nervi parasimpatici che rilasciano ACh / ATP di contrarre la vescica muscolo liscio 1. Numerose condizioni patologiche, tra cui il cervello e / o lesioni del midollo spinale, malattie neurodegenerative, diabete, ostruzione dello sbocco vescicale o cistite interstiziale, possono alterare profondamente la funzione della vescica, con grave impatto sulla qualità di vita del paziente 2. Queste condizioni alterano la contrattilità del muscolo liscio influendo uno o più componenti della vescica: il muscolo liscio, afferenti o nervi efferenti e / o lamucosa.
Diversi in vivo e metodi in vitro per studiare la funzione della vescica sono stati sviluppati. In vivo, cistometria è la misura primaria di funzione della vescica. Anche se questo è un preparato intatto che permette la raccolta di informazioni in condizioni prossime a quelle fisiologiche, ci sono una serie di circostanze in cui è preferibile l'utilizzo di strisce muscolari lisce. Questi includono situazioni quando chirurgica e / o manipolazioni farmacologiche possano pregiudicare la sopravvivenza e la stabilità della preparazione in vivo, o quando gli studi richiedono l'uso del tessuto umano o chimici costosi. Questo metodo facilita anche un esame degli effetti dei farmaci, età e patologia su ogni componente della vescica, cioè la muscolatura liscia, mucosa, afferenti ed efferenti nervi.
Strisce della vescica sono stati impiegati nel corso degli anni da molti gruppi per rispondere a una serie di questioni scientifiche. Essi sono stati usati per evacambiamenti luate in attività spontanea miogenico indotto dalla patologia. Questa attività è creduto di contribuire ai frequenza ed urgenza i sintomi della vescica iperattiva (OAB), ed è quindi un bersaglio per i farmaci in fase di sviluppo per OAB 3-9. Strisce della vescica sono stati utilizzati anche per studiare i fattori miogenici e neuronali che modulano il tono della muscolatura liscia con l'obiettivo di scoprire canali ionici e / o recettori e / o le vie intracellulari che potrebbero essere mirati per indurre il rilassamento sia o contrazione della muscolatura liscia 3,10- 13. Altri studi si sono concentrati sulla natura della neurotrasmissione, compresi trasmettitori e recettori coinvolti e variazioni indotte dalla patologia 14,15. Inoltre, il metodo è stato utilizzato per il confronto di tessuti da 18 a 16 specie diverse, tra organi 19-21, e la valutazione delle relazioni struttura-attività farmaco 22-24. Un'estensione di questo metodo è stato utilizzato per MEASURvia e l'effetto dei farmaci sul rilascio del trasmettitore da nervi efferenti 25. Inoltre, una varietà di tessuti (vescica, uretra, tratto gastrointestinale, GI) raccolti da animali o esseri umani (da interventi chirurgici o tessuti donatore di organi riconosciuti per la ricerca) e da una varietà di modelli animali tra cui lesioni del midollo spinale (SCI), della vescica presa di ostruzione (BOO), o cistite interstiziale (IC) possono essere studiate usando questa tecnica.
In questo articolo illustriamo l'uso di questo metodo insieme a necessari protocolli sperimentali, per risolvere diverse questioni scientifiche di cui sopra.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro abbiamo descritto un semplice metodo in vitro liscio contrattilità muscolare che può essere utilizzato per affrontare una serie di importanti questioni scientifiche relative alla fisiologia della vescica e della patologia, oltre a favorire la scoperta di nuovi farmaci per il trattamento di disfunzioni della vescica. Abbiamo illustrato l'utilizzo di questo metodo per valutare le proprietà di sviluppo, patologiche e farmacologiche di contrattilità della vescica muscolo liscio (fig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da NIH R37 e R01 DK54824 DK57284 sovvenzioni a LB.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and surgical instruments | |||
| sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
Referências
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
