Гладких мышц мочевого пузыря Газа Сократимость как метод оценки нижних мочевых путей фармакология
Summary
Эта рукопись представляет собой простой, но мощный, в методе экстракорпорального для оценки гладкую сократимость мышц в ответ на фармакологические препараты или стимуляции нерва. Основные области применения скрининг лекарств и понимание ткани физиология, фармакология, и патология.
Abstract
Мы описываем метод в пробирке для измерения пузыря гладкую сократимость мышц, и его использование для исследования физиологических и фармакологических свойств гладких мышц, а также изменения, вызванные патологией. Этот метод обеспечивает критически важную информацию для понимания функции мочевого пузыря, преодолевая основные методологические трудности, возникающие в в естественных условиях экспериментов, например, хирургических и фармакологических манипуляций, которые влияют на стабильность и выживание препаратов, использование человеческих тканей и / или использования дорогих химических веществ. Он также предоставляет возможность исследовать свойства каждого компонента мочевого пузыря (т.е. гладкой мускулатуры, слизистой оболочки, нервы) у здоровых и патологических состояний.
Мочевой пузырь удаляется из анестезированных животных, помещали в раствор Кребса и разрезали на полоски. Полоски помещают в камеру, заполненную теплой раствором Кребса. Один конец прикреплен к изометрической Tensioн датчика для измерения силы сжатия, а другой конец прикреплен к неподвижной штанги. Ткань стимулируют путем прямого добавления соединений в баню или путем электрической стимуляции электродов полевых, которые активируют нервы, похожие на срабатывание сокращения мочевого пузыря в естественных условиях. Мы демонстрируем использование этого метода для оценки спонтанной сократительной гладких мышц в процессе разработки и после экспериментального повреждения спинного мозга, природа синапсах (передатчиков и рецепторов, участвующих), факторы, влияющие на модуляции активности гладких мышц, роль отдельных компонентов мочевого пузыря, и виды и различия органов в ответ на фармакологические препараты. Кроме того, он может быть использован для исследования внутриклеточных путей, участвующих в сжатии и / или релаксации гладкой мышцы, наркотиков отношений структура-активность и оценки выпуска передатчика.
Гладкая метод мышцы сократимость в пробирке была широко FO используетсяг в течение 50 лет, и предоставил данные, которые внесли значительный вклад в наше понимание функции мочевого пузыря, а также фармацевтической разработке соединений в настоящее время используются клинически для управления мочевого пузыря.
Introduction
Мочевой пузырь гладкая мышца расслабляется, чтобы позволить хранение мочи, и контракты, чтобы выявить ликвидации мочи. Релаксация опосредуется внутренними гладкими свойствами мышечных и тоник выпуска норадреналина (NE) от симпатических нервов, который активирует бета адренорецепторов (β 3 AR в человека) в детрузора. Аннулирование достигается путем ингибирования симпатической вход и активации парасимпатических нервов, которые высвобождают АЧ / ATP заключить контракт гладких мышц мочевого пузыря 1. Многочисленные патологические состояния, в том числе головного мозга и / или спинного мозга, нейродегенеративных заболеваний, диабета, инфравезикальной обструкции или интерстициального цистита, может глубоко изменить функцию мочевого пузыря, с тяжелыми последствиями для качества пациента жизни 2. Эти условия изменяют сократительную способность гладкой мускулатуры путем воздействия одного или более компонентов мочевого пузыря: гладкие мышцы, афферентным или эфферентные нервы и / илиСлизистая оболочка.
Несколько в естественных условиях и в методах пробирке для изучения функции мочевого пузыря были разработаны. В естественных условиях, цистометрия является основным измерение функции мочевого пузыря. Хотя это нетронутыми подготовка, которая позволяет собирать информацию под близко к физиологическим условиям, существует ряд обстоятельств, при которых использование полос гладкой мускулатуры является предпочтительным. К ним относятся ситуации, когда хирургическое и / или фармакологические манипуляции повлияли бы выживание и стабильность препарата в естественных условиях, или когда исследования требуют использования ткани человека или дорогих химических веществ. Этот метод также облегчает экспертизу воздействия наркотиков, возраста и патологии на каждого компонента пузыря, т.е. гладкие мышцы, слизистую оболочку, афферентные и эфферентные нервы.
Мочевого пузыря полосы были использованы на протяжении многих лет многими группами, чтобы ответить на ряд научных вопросов. Они были использованы для выхода в открытый космосизменения luate в миогенной спонтанной активности индуцируется патологии. Эта деятельность, как полагают, в значительной степени актуализирует и частотных симптомов гиперактивного мочевого пузыря (OAB), и, следовательно, является мишенью для лекарств, которые разрабатываются для автономной адресной книги 3-9. Мочевого пузыря полосы были также использованы для расследования миогенные и нейронные факторы, которые модулируют тонус гладких мышц с целью обнаружения ионных каналов и / или рецепторы и / или внутриклеточные пути, которые могли бы быть нацелены, чтобы побудить либо расслабление или сокращение гладкой мускулатуры 3,10- 13. Другие исследования были сосредоточены на природе нервного, в том числе передатчиков и рецепторов, вовлеченных и изменений, вызванных патологией 14,15. Кроме того, этот метод был использован для сравнения между тканей из различных видов 16- 18, между органами 19-21, и оценки структуры-активности препарата отношений 22-24. Расширение этого метода был использован для измерения дэлектронной эффект препаратов на секрецию медиатора из эфферентных нервов 25. Кроме того, различные ткани (мочевой пузырь, мочеиспускательный канал, желудочно-кишечный тракт, ЖКТ) собирают из животных или человека (из операций или органа-донора ткани, одобренных для исследования) и из различных моделях животных, включая повреждением спинного мозга (SCI), инфравезикальной обструкции (BOO), или интерстициальный цистит (IC) могут быть исследованы с помощью этой техники.
В этой статье мы иллюстрируют использование этого метода наряду с необходимыми экспериментальных протоколов, для решения несколько научных вопросов, упомянутых выше.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описали простой в пробирке гладких мышц методом сократимости, которые могут быть использованы для решения ряда важных научных вопросов, связанных с физиологией мочевого пузыря и патологии, а также пособничество открытие новых препаратов для лечения дисфункций м?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано NIH R37 DK54824 и R01 DK57284 грантов LB.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and surgical instruments | |||
| sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
Referências
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
