Bladder Smooth Muscle Strip Kontraktilitet som en metod för att utvärdera Lower Urinary Tract farmakologi

Summary

Detta manuskript presenteras en enkel men kraftfull, in vitro-metod för utvärdering av glatt muskulatur kontraktilitet som svar på farmakologiska medel eller nervstimulering. Huvudsakliga användningsområden är drogscreening och förståelse vävnads fysiologi, farmakologi och patologi.

Abstract

Vi beskriver en in vitro-metod för att mäta blåsans glatta muskulatur kontraktilitet, och dess användning för att undersöka fysiologiska och farmakologiska egenskaperna hos den glatta muskulaturen samt förändringar inducerade av patologi. Denna metod ger viktig information för att förstå blåsfunktion samtidigt undvika större metodologiska svårigheterna med in vivo-experiment, såsom kirurgiska och farmakologiska manipulationer som påverkar stabiliteten och överlevnaden av preparaten, användning av mänsklig vävnad, och / eller användningen av dyra kemikalier. Det ger också ett sätt att undersöka egenskaperna för varje blåskomponent (dvs. glatt muskulatur, slemhinna, nerver) hos friska och patologiska tillstånd.

Den urinblåsan avlägsnas från en sövd djur, placerades i Krebs lösning och skars i remsor. Remsorna placeras i en kammare fylld med varm Krebs lösning. Den ena änden är fäst till en isometrisk tensidn omvandlare för att mäta sammandragning kraft, är den andra änden fäst till en fast stång. Tissue stimuleras genom att direkt lägga föreningar till badet eller från elektriska fält stimuleringselektroder som aktiverar nerver, liknande utlösande blåskontraktioner in vivo. Vi visar att användningen av denna metod för att utvärdera spontan glatt muskulatur kontraktilitet under utveckling och efter en experimentell ryggmärgsskada, vilken typ av neurotransmission (sändare och receptorer inblandade), faktorer som modulering av glatt muskulatur aktivitet, vilken roll enskilda blåskomponenter, och arter och skillnader organ som svar på farmakologiska medel. Dessutom kan den användas för att undersöka intracellulära signalvägar involverade i kontraktion och / eller avslappning av den glatta muskulaturen, drog struktur-aktivitetssamband och utvärdering av transmittorfrisättning.

Den in vitro-glatt muskel kontraktilitet metod har använts i stor omfattning for över 50 år och har lämnat uppgifter som kraftigt bidragit till vår förståelse av blåsfunktion samt läkemedelsutveckling av föreningar som för närvarande används kliniskt för blåsledningen.

Introduction

Blåsan glatta muskulaturen slappnar tillåta urin lagring och kontrakt för att framkalla eliminering urin. Avkoppling förmedlas av inneboende glatta muskelegenskaper och tonic frisättning av noradrenalin (NE) från de sympatiska nerver som aktiverar beta-adrenerga receptorer (β ₃ pa i människa) i detrusor. Tömning sker genom att hämma sympatiska ingång och aktivera parasympatiska nerver som frigör ACh / ATP att ingå avtal blåsan glatt muskulatur ^1. Många sjukdomstillstånd, inklusive hjärna och / eller ryggmärgsskada, neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, urinblåsan utlopp obstruktion eller interstitiell cystit, kan i grunden förändra blåsfunktion, med allvarliga konsekvenser för patientens livskvalitet ^2. Dessa förhållanden ändrar kontraktilitet i glatt muskulatur genom att påverka en eller flera komponenter i urinblåsan: den glatta muskulaturen, afferenta eller efferenta nerver och / ellerslemhinnan.

Flera in vivo och in vitro-metoder för att studera blåsfunktionen har utvecklats. In vivo är cystometri den primära mätningen av blåsfunktionen. Även om detta är en intakt beredning som möjliggör insamling av information enligt nära fysiologiska förhållanden, det finns ett antal omständigheter där användningen av glatt muskulatur remsor är att föredra. Dessa innefattar situationer då kirurgisk och / eller farmakologiska manipulationer skulle påverka överlevnad och preparatets stabilitet in vivo, eller när studierna kräver användning av mänskliga vävnader eller dyra kemikalier. Metoden underlättar också en undersökning av effekterna av droger, ålder och patologi på varje komponent i blåsan, dvs glatt muskulatur, slemhinna, afferenta och efferenta nerver.

Bladder remsor har använts under årens lopp av många grupper för att besvara ett antal vetenskapliga frågor. De användes för att evaluate förändringar i myogenic spontan aktivitet inducerad av patologi. Denna aktivitet tros bidra till ärendets brådskande karaktär och frekvens symtom på överaktiv blåsa (OAB), och är därför ett mål för läkemedel som utvecklas för OAB ^3-9. Bladder remsor användes också för att undersöka myogena och neuronala faktorer som modulerar slät muskeltonus i syfte att upptäcka jonkanaler och / eller receptorer och / eller intracellulära signalvägar som kan riktade för att inducera antingen avkoppling eller sammandragning av glatt muskulatur ^{3,10- 13.} Andra studier har fokuserat på den typ av neurotransmission, inklusive sändare och receptorer är inblandade och förändringar inducerade av patologi ^14,15. Dessutom har metoden använts för jämförelser mellan vävnader från olika arter ^{16- 18,} mellan organ ^19-21 och utvärdering av läkemedels struktur-aktivitetssamband ^22-24. En utvidgning av denna metod har använts för att MEASURe effekten av droger på transmittorfrisättning från efferenta nerver ^25. Dessutom en mängd olika vävnader (urinblåsa, urinrör, mag-tarmkanalen, GI) skördas från djur eller människor (från operationer eller organdonatorvävnad godkända för forskning) och från en mängd olika djurmodeller, inklusive ryggmärgsskada (SCI), urinblåsan utlopp obstruktion (BOO) eller interstitiell cystit (IC) kan undersökas med hjälp av denna teknik.

I denna uppsats belyser vi användning av denna metod tillsammans med nödvändiga experimentella protokoll, ta upp flera vetenskapliga frågor som nämns ovan.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs här är godkända av IACUC kommittén vid University of Pittsburgh. 1. Lösningar Bered Krebs lösning enligt receptet. Sammansättning i mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO 4 1.2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1.2, dextros 11.7. Lufta Krebs med 95% O2, 5% CO2 och placera den i ett 37 ° C vattenbad för att användas under hela experimentet. Placera undan ~ 200 ml l…

Representative Results

Spontan Myogenic Aktivitet Spontan myogena aktivitet är en viktig glatt muskulatur egenskap som genomgår förändringar med postnatal utveckling 6-9 och patologi (t.ex. SCI, BOO) 3-5. Eftersom denna verksamhet anses bidra till symtom på överaktiv blåsa (OAB) 2, är av stort intresse för att utveckla effektiva behandlingar för OAB och andra glatta muskel dysfunktioner en utvärdering av receptorer, intracellulära signalvägar …

Discussion

I denna uppsats beskrev vi en enkel in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metod som kan användas för att ta itu med ett antal viktiga vetenskapliga frågor som rör urinblåsan fysiologi och patologi, samt medhjälp upptäckten av nya läkemedel för behandling av urinblåsan dysfunktioner. Vi har illustrerat att använda denna metod för att bedöma utvecklings, patologiska och farmakologiska egenskaper blåsan glatt muskulatur kontraktilitet (figurer 2-4), neurotransmission modulation <s…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and surgical instruments
sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:                             Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride	Sigma                                    Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions