Glat muskulatur i blæren Strip Kontraktilitet som en metode til at evaluere nedre urinveje Farmakologi

Summary

Dette håndskrift præsenterer en enkel, men kraftfuld, in vitro-metode til evaluering af den glatte muskulatur kontraktilitet som reaktion på farmakologiske midler eller nerve stimulation. Vigtigste anvendelser er narkotika screening og forståelse væv fysiologi, farmakologi og patologi.

Abstract

Vi beskriver en in vitro-metode til måling af glat muskulatur i blæren kontraktilitet og dets anvendelse til undersøgelse af fysiologiske og farmakologiske egenskaber af den glatte muskulatur samt ændringer induceret af patologi. Denne metode giver vigtige oplysninger for forståelsen af blære funktion, mens overvinde væsentlige metodologiske vanskeligheder i in vivo forsøg, såsom kirurgiske og farmakologiske manipulationer, der påvirker stabiliteten og overlevelsen af de præparater, anvendelse af humant væv og / eller brug af dyre kemikalier. Det giver også en måde at undersøge egenskaberne for hver enkelt blære komponent (dvs. glat muskulatur, slimhinder, nerver) hos raske og patologiske tilstande.

Urinblæren fjernes fra et bedøvet dyr, anbringes i Krebs-opløsning og skåret i strimler. Strimlerne anbringes i et kammer fyldt med varm Krebs-opløsning. Den ene ende er fastgjort til en isometrisk overfladeaktivitetn transducer til at måle kontraktion kraft, den anden ende fastgjort til en fast stang. Væv stimuleres ved direkte tilsætning af forbindelser til badet eller ved elektrisk feltstimulering elektroder, der aktiverer nerver, svarende til udløsning blærekontraktioner in vivo. Vi demonstrere brugen af ​​denne metode til at evaluere spontan glatte muskler kontraktilitet under udviklingen og efter en eksperimentel rygmarvsskade, arten af ​​neurotransmission (sendere og receptorer, der er involveret), faktorer involveret i modulering af glatte muskel aktivitet, rolle enkelte blære komponenter og arter og orgel forskelle i respons på farmakologiske midler. Derudover kan det bruges til at undersøge intracellulære signalveje involveret i sammentrækning og / eller afslapning af den glatte muskulatur, narkotika struktur-aktivitet-relationer og evaluering af senderen udgivelse.

In vitro-glat muskel kontraktilitet metode har været anvendt i udstrakt grad for over 50 år, og har leveret data, der væsentligt har bidraget til vores forståelse af blære funktion samt til farmaceutisk udvikling af forbindelser i øjeblikket anvendes klinisk til blære ledelse.

Introduction

Blæren glatte muskulatur slapper at tillade urin opbevaring og kontrakter for at fremkalde urin elimination. Afslapning er medieret af iboende glatte muskelceller egenskaber og tonic frigørelse af noradrenalin (NA) fra de sympatiske nerver, som aktiverer beta-adrenerge receptorer (β ₃ AR i menneskelig) i detrusor. Voiding opnås ved at hæmme sympatisk input og aktivere det parasympatiske nerver, der frigiver ACh / ATP til sammentrække glat muskulatur i blæren ^1. Talrige patologiske tilstande, herunder hjerne og / eller rygmarvsskade, neurodegenerative sygdomme, diabetes, blæreafløbshindring eller interstitiel cystitis, kan dybt ændre blære funktion, med alvorlig indvirkning på patientens livskvalitet ^2. Disse betingelser ændrer kontraktilitet af den glatte muskulatur ved at påvirke en eller flere komponenter i blæren: den glatte muskulatur, afferente eller efferente nerver og / ellerslimhinde.

Adskillige in vivo og in vitro metoder til at studere blære funktion er blevet udviklet. In vivo cystometry er den primære måling af blærefunktion. Selvom dette er et intakt præparat, der tillader indsamling af oplysninger under tæt på fysiologiske betingelser, er der en række forhold, hvor brugen af ​​glatte muskelceller strimler foretrækkes. Disse omfatter situationer, hvor kirurgisk og / eller farmakologiske manipulationer kan påvirke overlevelse og stabilitet in vivo forberedelse, eller når undersøgelser vil kræve anvendelse af humant væv eller dyre kemikalier. Denne metode fremmer også en undersøgelse af virkningerne af narkotika, alder og patologi på hver komponent af blæren, dvs glat muskulatur, slimhinder, afferent og efferente nerver.

Blære strimler har været beskæftiget i årenes løb af mange grupper til at besvare en række videnskabelige spørgsmål. De blev anvendt til at evaluate ændringer i myogene spontan aktivitet induceret af patologi. Denne aktivitet menes at medvirke til, hvor meget og frekvens symptomer på overaktiv blære (OAB), og er derfor et mål for lægemidler, der udvikles til OAB ^3-9. Blære strimler blev også brugt til at undersøge myogene og neuronale faktorer, der modulerer glat muskel-tonus med det formål at opdage ionkanaler og / eller receptorer, og / eller intracellulære signalveje, der kan målrettes til at inducere enten afslapning eller sammentrækning af den glatte muskulatur ^{3,10- 13.} Andre undersøgelser har fokuseret på arten af neurotransmission, herunder sendere og receptorer involveret og ændringer induceret af patologi ^14,15. Desuden er metoden blevet brugt til sammenligninger mellem væv fra forskellige arter ^{16- 18,} mellem organerne ^19-21, samt evaluering af narkotika struktur-aktivitets relationer ^22-24. En udvidelse af denne fremgangsmåde er blevet anvendt til measure effekten af lægemidler på senderen frigivelse fra efferente nerver ^25. Endvidere en række forskellige væv (blære, urinrøret, mave-tarmkanalen, GI) høstet fra dyr eller mennesker (fra kirurgi eller organdonor væv godkendt til forskning) og fra en række forskellige dyremodeller, herunder rygmarvsskade (SCI), blæreafløbshindring (BOO) eller interstitiel cystitis (IC) kan undersøges ved hjælp af denne teknik.

I dette papir vil vi illustrere brugen af ​​denne metode sammen med de nødvendige forsøgsprotokoller, til at behandle en række videnskabelige spørgsmål, der er nævnt ovenfor.

Protocol

Alle procedurer er beskrevet her, er godkendt af IACUC udvalget på University of Pittsburgh. 1. Opløsninger Forbered Krebs-opløsning i henhold til opskriften. Sammensætning i mM: NaCI 118, KCI 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24,9 KH 2 PO4 1,2, dextrose 11,7. Luftes Krebs med 95% O 2, 5% CO2 og placere den i et 37 ° C vandbad skal anvendes i hele eksperimentet. Placer side ~ 200 ml beluftet Krebs-opl…

Representative Results

Spontan Myogenic aktivitet Spontan myogenic aktivitet er en vigtig glatte muskulatur egenskab, der gennemgår ændringer med postnatal udvikling 6-9 og patologi (fx SCI, BOO) 3-5. Fordi denne aktivitet menes at bidrage til symptomerne på overaktiv blære (OAB) 2, er en evaluering af receptorer, intracellulære signalveje og farmakologiske midler, som modulerer det, af stor interesse for at udvikle effektive behandlinger for OAB og a…

Discussion

I dette papir, vi beskrev en simpel in vitro glat muskel kontraktilitet metode, der kan bruges til at løse en række vigtige videnskabelige spørgsmål i forbindelse med blære fysiologi og patologi, samt medvirken til opdagelsen af nye lægemidler til behandling af blære dysfunktioner. Vi har illustreret brugen af denne metode til vurdering af udviklingsmæssige, patologiske og farmakologiske egenskaber af glat muskulatur i blæren kontraktilitet (figur 2-4), neurotransmission modulation <st…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and surgical instruments
sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:                             Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride	Sigma                                    Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions