Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN.

Abstract

Les dernières décennies ont vu l'explosion de l'intérêt scientifique autour des mécanismes de contrôle de l'expression des gènes au niveau de l'ARN. Cette branche de la biologie moléculaire a été fortement alimentée par la découverte de non codantes des ARN comme des acteurs majeurs dans la régulation post-transcriptionnelle. Une telle perspective révolutionnaire a été accompagnée et déclenchée par le développement de technologies puissantes pour le profilage des ARN courte expression, à la fois au niveau haut débit (identification du génome entier) ou analyse d'un seul candidat (accumulation de l'état d'équilibre des espèces spécifiques). Bien que plusieurs stratégies état de l'art sont actuellement disponibles pour le dosage ou la visualisation de ces molécules fuyant, analyse Northern Blot reste l'approche droit dans la biologie moléculaire pour l'évaluation immédiate et précise de l'expression de l'ARN. Il constitue une première étape vers l'application de technologies coûteuses, plus sophistiqués et, dans de nombreux cas, reste une méthode préférentielle pour gagner facilement des idéesARN en biologie. Ici, nous aperçu un protocole efficace (Enhanced Northern Blot) pour détecter les microARN faiblement exprimés (ou d'autres espèces de petits ARN réglementaires) de Drosophila melanogaster embryons entiers, disséqué manuellement tissus / adultes larvaires ou dans des cellules cultivées in vitro. Une quantité très limitée de l'ARN est nécessaire et l'utilisation du matériel de flux cellules cytométrie isolées peuvent être également envisagée.

Introduction

ARN biochimie a connu progrès spectaculaires au cours des dernières années ^1. Notre compréhension du potentiel de l'ARN dans le contrôle de l'expression génique a été éclaté par l'identification des puissants ribo-régulateurs non codants ^2, par la découverte de nouveaux mécanismes de régulation à base d'ARN ^3,4 et par une caractérisation détaillée des événements post-transcriptionnelle déjà connues ^5. Tous biologie de l'ARN ensemble, ces études ont permis de faire considérablement la scène, devenant un important sujet de recherche dans le paysage scientifique actuel. En particulier, au cours des dernières années, nous obtenons une idée de l'impact profond du «monde de l'ARN" sur la neurobiologie moléculaire ^6, l'un des domaines de recherche les plus dynamiques en sciences de la vie moderne. Dans la dernière décennie du siècle passé, le scénario scientifique globale a été révolutionné par la découverte de l'interférence ARN ^7,8 et des petits ARN régulateurs ^9,10notamment en ce qui concerne les micro-ARN ¹¹ exprimé de manière endogène de petits ARN non codantes impliquées dans le contrôle de la quasi-totalité des fonctions cellulaires en tant que régulateurs pléiotropes et combinatoires de l'expression génique.

Près de 10 ans après la découverte initiale miARN dans Caenorhabditis elegans par Ambros et les laboratoires de Ruvkun, une attention renouvelée a été tourné dans le champ quand un grand nombre de miARN ont été identifiés chez la drosophile et dans les cellules humaines ainsi ^12-15. Depuis lors, grâce à des approches transgéniques polyvalents, Drosophila melanogaster s'est distingué comme un contexte biologique précieux pour se plonger dans la biosynthèse des miARN et de l'activité. Drosophila miARN ont révélé des fonctions distinctes dans les processus d'insectes spécifiques ou évolutives conservées, allant de vieillissement de métabolisme, les voies de signalisation , le comportement et, bien sûr, la neurogenèse. Le long de cette direction, nous avons récemment dévoilé un lien nouveau ¹⁶ dans le co intriganterrelation survenant entre le gène maître gcm / descente et la voie de l'ARN. Le facteur de transcription Gcm mouche / Glide ^17-19 constitue un exemple unique de destin cellulaire déterminant, qui dicte le choix de gliale vs destinée neuronale dans multipotentes voler précurseurs neuraux ^20. Vingt ans de longues recherches sur ce sujet a clairement souligné l'apparition de multiples entrées et se chevauchent de la régulation de l'expression des gènes convergent sur ​​gcm / glisser ^21-28 pour établir les seuils requis pour équilibrer le rapport délicat entre homologues neuronales et gliales au cours du développement neuronal.

Nous avons découvert que la régulation par DMEL-miR279 ciblage représente un niveau supplémentaire de contrôle contribuant à la post-transcriptionnelle de réglage fin de gcm / glisser expression ^16. Améliorations méthodologiques spécifiques à l'échelle mondiale, ces lignes de recherche ont requis: le long des années, plusieurs technologies initialement développées pour analyser tradARN tradition- ont été convertis pour quantifier les petits ARN non codantes, comme tant RNase de protection, d'ADNc tableaux ^29-31, méthodes de PCR en temps réel ^32-35 et le séquençage de ^36,37. De l'autre côté, le recalibrage des approches techniques a favorisé progrès continus dans le domaine.

Northern Blot dosage (NB, ou une analyse par transfert sur gel d'ARN) constitue un exemple représentatif: il est largement utilisé pour le profil de l'accumulation de l'ARN, car elle assure à la fois le niveau d'expression de quantification, ainsi que la détermination de la taille. Cependant, la faible sensibilité intrinsèque de la méthode est de limiter quand il est appliqué à l'expression des gènes tendeurs faible abondance, comme les ARN courts. Une conséquence néfaste est l'exigence de grandes quantités d'ARN total, ce qui rend difficile son application à des échantillons biologiques spécifiques. Pour ces raisons, les variantes NB spécifiques pour la détection des ARN petit ont été développés ^38-40: nous avons profité d'un proc NB amélioréeedure ⁴¹ (ENB, Enhanced Northern Blot), tandis que l'élucidation du jeu susmentionné entre DMEL-miR279 et gcm / descente.

Cette méthode repose sur une étape de réticulation chimique sur la base de l'activité d'un dérivé de carbodiimide [1-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, EDC] pour fixer l'acide nucléique sur des supports solides. Carbodiimide est un agent de réticulation polyvalent connu pour catalyser la formation de liaisons amide entre les groupes carboxyle activés ou phosphate et des groupes amine ^42. Cette propriété peut être exploitée pour coupler de manière covalente par l'intermédiaire de leurs petits ARN groupe 5'-hydroxyle mono-phosphorylé aux groupes amino à la surface des membranes de nylon. La configuration résultant de fixation augmente l'accessibilité de l'acide nucléique immobilisé et, par conséquent, l'efficacité de l'hybridation sonde-cible, ce qui conduit à l'amélioration remarquable de détection ^43.

La technique suppose notamment relevance dans des études moléculaires de Drosophila, qui par l'apparition de nouvelles catégories distinctes et de petits ARN non codants de ⁴⁴ émerge. Parmi ceux-ci, rasiRNAs ^45,46 constituent un sous-type spécifique des ARN Piwi-interacting (piRNAs ^47), impliqués dans l'inactivation de gène spécifique à la séquence. Détails opérationnels de cette méthode sont décrits en détail et visualisés ci-après, par rapport à l'analyse de la microARN DMEL-miR279 et DMEL-miR286 et, pour la première fois, d'une rasiRNA, rasi4. Nous avons poussé à l'extrême cette méthode, qui nous a permis révélant des objectifs mal exprimés à partir des quantités minimes de l'ARN (moins de 1 ug).

Protocol

Collection 1 de l'échantillon Détachez 2 cellules de semi-adhérent, Schneider (1-5 x 10 6 cellules en moyenne), à la pipette et les récolter par centrifugation (100 g pendant 1 min). Dans le cas de cellules adhérentes en culture in vitro, trypsiniser eux dans des conditions standard ou directement à percevoir ces plaques dans une quantité convenable d'ARN réactif d'extraction, par l'aide d'un grattoir à cellules. Pour la collecte des embryons, dével…

Representative Results

En suivant la procédure générale décrite dans le texte et représentés schématiquement sur ​​la figure 1, nous avons évalué l'expression de petits ARN à partir d'échantillons d'ARN complexes de différentes origines. Dans l'expérience présentée à la figure 1, l'ARN a été isolé à partir de 2 cellules de Drosophila Schneider par extraction à la protéinase K, vérifiés pour l'intégrité (étape optionnelle: dénaturation agarose fr…

Discussion

Bien que notre appréciation de l'entrelacement sophistiqué par lequel l'ARN régule la neurogenèse est en constante augmentation, les implications mécanistiques de circuiteries à base d'ARN qui affectent neurones biologie des cellules souches, la différenciation neuronale / intégration fonctionnelle, le développement de pathologies et cancers de neurones restent inexplorées. Le maintien de ces réseaux par les royaumes rend le potentiel des systèmes génétiques Drosophila melanogaster con…

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME	COMPANY	CATALOGUE (Stock)	COMMENTS
			GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension			Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
			SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
			RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026	Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer			Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
			SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM boric acid	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
1x RB			Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
			BLOTTING
3MM Whatman paper	Sigma-Aldrich	Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
			CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
			(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter	Beckmann	LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 antisense probe			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE			Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer	Biolabs	B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
			WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
			SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System	Biorad	170-9460
Image J	Freely available
Quantity One	Biorad
X-ray films , BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Photosensitive
Developer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7042
Fixer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7167
			STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3