Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
Cellule NG2 che esprimono (polydendrocytes, cellule precursori degli oligodendrociti) sono la quarta maggiore popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale. Durante lo sviluppo embrionale e postnatale che proliferano attivamente e generano oligodendrociti mielinizzanti. Queste cellule sono state comunemente studiate in colture primarie dissociate, co-colture di neuroni, e nel tessuto fisso. Utilizzo di recente disponibili linee di topi transgenici fetta sistemi di coltura possono essere utilizzati per studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule oligodendrociti lineage in entrambe le regioni grigi e bianchi questione di proencefalo e cervelletto. Culture fetta sono preparati dai primi topi postnatale e sono tenuti in coltura per fino a 1 mese. Queste sezioni possono essere esposte più volte nel corso del periodo di coltura per studiare il comportamento e le interazioni cellulari. Questo metodo permette la visualizzazione di divisione cellulare NG2 e le fasi che portano alla differenziazione degli oligodendrociti consentendo un'analisi dettagliata della regione dipendeent cellule NG2 e oligodendrociti eterogeneità funzionale. Questa è una tecnica potente che può essere usato per studiare i segnali intrinseci ed estrinseci che influenzano queste cellule nel tempo in un ambiente cellulare che si avvicina a quella trovata in vivo.
Introduction
Culture fetta Organoytpic del sistema nervoso centrale, hanno dimostrato di essere estremamente utile per lo studio dei neuroni e della biologia delle cellule gliali in un sistema semiintact 1 – 4. Queste culture sono relativamente semplici da adottare e mantenere molti benefici di colture primarie di cellule dissociate, come manipolazione dell'ambiente extracellulare e di facile accesso per i ripetuti a lungo termine imaging cellulare dal vivo e registrazioni elettrofisiologiche 5-9. Inoltre, culture fetta mantengono citoarchitettura tessuto 3-dimensionale, connettività neurale regionale, e la maggior parte dei tipi di cellule principali sono presenti nel sistema. Queste proprietà fanno di queste culture un sistema unico e conveniente per studiare il comportamento di singole cellule e fisiologia con interazioni cellulari e ambientali.
Cellule NG2 sono una popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale dei mammiferi che continuano a proliferare e generare myelinating oligodendrociti durante lo sviluppo embrionale e postnatale 10. Essi sono stati ampiamente studiati in colture cellulari primarie dissociate, e recente sviluppo di linee di topi transgenici con espressione specifica delle cellule NG2 di proteine fluorescenti ha facilitato nella mappatura vivo destino e registrazioni elettrofisiologiche in fettine acute. Anche con questi studi, poco si sa circa le dinamiche temporali di proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti. Sebbene coltura cellulare dissociata è ampiamente usato per la relativa facilità di manipolazioni farmacologiche e genetiche, non è adatto per interrogare differenze funzionali di queste cellule in differenti regioni cerebrali in particolare quando è desiderabile mantenere contesto del microambiente cellulare. Culture fetta forniscono una semplice alternativa che è suscettibile di manipolazioni farmacologiche e sono stati utilizzati per indagare oligodendrociti mielinizzazione 11,12, cellulerisposta colare dopo lisolecitina (LPC) o di anticorpi indotta demielinizzazione 13,14, e l'induzione di rimielinizzazione tramite trattamento farmacologico 15.
Un metodo per indagare ed eseguire l'imaging dal vivo e tessuto fissato (o postfixation) analisi della proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti in culture fetta organotipica prelevati sia dal prosencefalo e il cervelletto è descritto. Questo è un metodo potente che può essere utilizzato per studiare il destino delle cellule di singole cellule NG2 dopo la divisione 16 e per scoprire le differenze o una regione e di età-dipendente in fattore di crescita NG2 indotta proliferazione cellulare 17. Questo relativamente semplice tecnica è ampiamente accessibile di approfondire intrinseca e / o ambientale cella meccanismi che regolano la fisiologia di queste cellule gliali e la loro risposta all'attività neuronale o danneggiamento della mielina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mielinizzazione nel sistema nervoso centrale è essenziale per un'efficiente comunicazione neuronale e la sopravvivenza assonale 22. Cellule NG2 continuano a generare oligodendrociti mielinizzanti in età adulta, pur mantenendo una popolazione residente nella maggior parte delle regioni del cervello 16,23 – 25. Alcuni meccanismi genetici e molecolari che regolano il differenziamento di queste cellule sono state descritte, ma resta ancora molto da scoprire. Culture fetta organotipica sono un com…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
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