Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
NG2 발현 세포 (polydendrocytes, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포)는 중추 신경계에서 주요한 넷째 신경교 세포 집단이다. 배아 및 출생 후의 개발하는 동안 그들은 적극적으로 증식 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이 세포는 일반적으로 기본 해리 문화, 신경 세포 공 배양 연구, 고정 조직되었다. 새로 사용 가능한 트랜스 제닉 마우스 선이 배양 시스템은 전뇌와 소뇌 모두 회색과 백질 영역에 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 증식과 분화를 조사하는데 사용될 수있는 슬라이스. 슬라이스 문화는 출생 초기 마우스에서 준비가되어 1 개월까지에 대한 문화에 보관됩니다. 이 조각은 세포의 행동과 상호 작용을 조사하기 위해 배양 기간 동안 여러 번 이미지를 만들 수 있습니다. 이 방법은 NG2의 세포 분열의 시각화와의 상세한 분석을 가능하게하고있는 동안 희소 돌기 아교 세포의 분화로 이어지는 단계 지역별 의존 할 수 있습니다천만에 NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포 기능 이질성. 이는 생체 내에서 밀접 발견 유사한 셀룰러 환경에서 시간 경과에 영향을 미치는 이러한 세포 및 극한 외부 신호를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다.
Introduction
4 – 중추 신경계 Organoytpic 슬라이스 배양 semiintact 시스템 (1)의 뉴런 및 신경교 세포 생물학을 연구하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 9 – 이러한 문화를 채택하고 세포 외 환경의 조작을 반복 장기 라이브 세포 이미징에 대한 쉬운 접근과 전기 생리 레코딩 (5)이 기본으로 해리 된 세포 배양의 많은 혜택을 유지하기가 비교적 간단하다. 또한, 슬라이스 배양 3 차원 조직 cytoarchitecture 지역 신경 연결을 유지하고, 가장 중요한 세포 유형은 시스템에 존재한다. 이러한 특성은 세포와 환경의 상호 작용으로 단일 세포의 행동과 생리를 조사하기 위해 이들 문화에 고유 한 편리한 시스템을 확인합니다.
NG2 세포 증식 및 m을 계속 생성 포유류의 중추 신경계에서 신경교 세포 집단이다배아 및 출생 후의 개발 10 동안 희소 돌기 아교 세포를 yelinating. 이들은 광범위 해리 일차 세포 배양에서 연구되었으며, NG2 형광 단백질의 세포 특이 식 트랜스 제닉 마우스 라인의 최근의 발전은 급성 슬라이스 제제의 생체 내 거동 매핑 및 전기 생리 레코딩에서 촉진했다. 비록 이러한 연구와 거의 NG2 세포 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간적 역학에 대해 공지되어있다. 해리 된 세포 배양 물을 광범위하게 약리 유전 조작에 대하여 설비를 위해 사용되지만, 그것은 세포의 미세 환경의 컨텍스트를 유지하는 것이 바람직하다 특히 다른 뇌 영역에서 이들 세포의 기능 차이를 질의에 적합하지 않다. 슬라이스 배양 세포 약리 조작에 대한 의무이며, 희소 돌기 아교 세포의 수초화 (11, 12)을 조사하기 위해 사용 된 간단한 대안을 제공(LPC)을 lysolecithin 또는 항체 약물 치료 15를 통해 탈수 초화 13, 14, 및 재유 수화 유도를 유도 한 후 신경근 응답.
방법은 조사 및 라이브 영상 및 고정 조직 (또는 postfixation) 전뇌와 소뇌에서 모두 촬영 Organotypic 슬라이스 문화의 NG2 세포의 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 분석 설명을 수행 할 수 있습니다. 이 16 분할 한 후 NG2 세포 세포의 운명을 연구하고 성장 인자 유도 NG2 세포 증식 17 인 지역, 연령 의존적 차이를 발견하는데 사용될 수있는 강력한 방법이다. 이 상대적으로 간단한 기술은 또한 고유 및 / 또는 환경이 아교 세포의 생리학 및 신경 세포의 활동이나 수초의 손상에 대한 반응을 조절하는 메커니즘을 세포를 조사하기 위해 광범위하게 액세스 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중추 신경계의 수초화 효율적으로 신경 세포의 통신 및 축삭의 생존 22 필수적이다. 25 – 대부분의 뇌 영역 16,23의 거주 인구를 유지하면서 NG2 세포는 지속적으로 성인에 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이러한 세포의 분화를 조절 일부 유전 및 분자 메커니즘을 설명했지만 많이 발견되고 남아있다. Organotypic 슬라이스 배양 인해 해부학 영역, 세포 외 환경의 쉬?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
Referências
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