Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
Células que expresan NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrocitos) son la cuarta población de células gliales importante en el sistema nervioso central. Durante el desarrollo embrionario y postnatal proliferan activamente y generar oligodendrocitos myelinating. Estas células han sido comúnmente estudiado en cultivos primarios de neuronas disociadas, cocultivos, y en tejido fijado. Uso de líneas de ratones transgénicos recientemente disponibles cortan sistemas de cultivo pueden usarse para investigar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos en ambas regiones de materia gris y blanca del cerebro anterior y el cerebelo. Cultivos de corte se preparan a partir de ratones postnatales tempranas y se mantienen en cultivo hasta por 1 mes. Estos cortes se pueden visualizar varias veces durante el período de cultivo para investigar el comportamiento celular y las interacciones. Este método permite la visualización de la división celular NG2 y los pasos que conducen a la diferenciación de oligodendrocitos al tiempo que permite un análisis detallado de la región-dependenent células NG2 y la heterogeneidad funcional de oligodendrocitos. Esta es una técnica poderosa que se puede utilizar para investigar las señales intrínsecos y extrínsecos que influyen en estas células a través del tiempo en un entorno celular que se asemeja mucho a la que se encuentra in vivo.
Introduction
Cultivos de corte Organoytpic del sistema nervioso central han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de las neuronas y la biología de las células gliales en un sistema semiintact 1-4. Estos cultivos son relativamente fáciles de adoptar y mantener muchos beneficios de los cultivos de células disociadas primarios tales como la manipulación del ambiente extracelular y fácil acceso para imágenes de células vivas repetida a largo plazo y los registros electrofisiológicos 5-9. Además, cultivos de cortes de tejido mantienen citoarquitectura 3-dimensional, la conectividad neuronal regional, y la mayoría de tipos de células principales están presentes en el sistema. Estas propiedades hacen que estas culturas un sistema único y conveniente para investigar el comportamiento de una sola célula y fisiología con las interacciones celulares y ambientales.
NG2 células son una población de células gliales en el sistema nervioso central de los mamíferos que continúan proliferando y generar myelinating oligodendrocitos durante el desarrollo embrionario y postnatal 10. Se han estudiado extensivamente en cultivos celulares primarios disociados, y reciente desarrollo de líneas de ratones transgénicos con NG2 expresión específica de célula de proteínas fluorescentes ha facilitado suerte de cartografía vivo y registros electrofisiológicos en preparaciones rebanada agudas en. Incluso con estos estudios, se sabe poco sobre la dinámica temporal de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2. Aunque el cultivo de células disociada es ampliamente utilizado para la instalación relativa en las manipulaciones farmacológicas y genéticas, que no es adecuado para interrogar a diferencias funcionales de estas células en diferentes regiones del cerebro en particular cuando es deseable mantener el contexto de la microambiente celular. Cultivos de cortes proporcionan una alternativa simple que es susceptible de manipulaciones farmacológicas y se han utilizado para investigar la mielinización de oligodendrocitos 11,12, célulaular respuesta después de lisolecitina (LPC) o el anticuerpo induce desmielinización 13,14, y la inducción de remielinización mediante tratamiento farmacológico 15.
Un método para investigar y realizar imágenes en vivo y tejido fijado (o post-fijación) análisis de la proliferación celular y la diferenciación de oligodendrocitos NG2 en cultivos de cortes organotípicos tomadas tanto desde el cerebro anterior y el cerebelo se describe. Este es un poderoso método que se puede utilizar para estudiar el destino celular de las células individuales NG2 después de la división 16 y para descubrir diferencias de región y dependientes de la edad en el factor de crecimiento inducido por la proliferación de células NG2 17. Esta técnica es relativamente simple ampliamente accesible a investigar más a fondo celular intrínseco y / o ambiental mecanismos que regulan la fisiología de estas células gliales y su respuesta a la actividad neuronal o daño de mielina.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mielinización en el sistema nervioso central es esencial para la comunicación eficiente neuronal y la supervivencia axonal 22. Células NG2 generan continuamente oligodendrocitos myelinating en la edad adulta, mientras que el mantenimiento de una población residente en la mayoría de las regiones del cerebro 16,23 – 25. Algunos de los mecanismos genéticos y moleculares que regulan la diferenciación de estas células han sido descritas, pero mucho queda por descubrir. Cultivos de cortes orga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
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