Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita. Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.
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Artigo de método
Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células que expressam NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrócitos) são a quarta maior população de células da glia do sistema nervoso central. Durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal eles ativamente proliferar e gerar oligodendrócitos myelinating. Estas células têm sido vulgarmente estudada em culturas dissociadas de neurónios primárias, co-culturas, e em tecido fixado. Utilizando linhas de ratinhos transgénicos fatia recentemente disponíveis sistemas de cultura pode ser utilizado para investigar a proliferação e diferenciação de células da linhagem de oligodendrócitos em ambas as regiões de matéria cinzenta e branca do cérebro anterior e do cerebelo. Culturas de fatias são preparadas a partir de ratos pós-natais precoces e são mantidas em cultura durante 1 mês. Estas fatias podem ser fotografada várias vezes ao longo do período de cultura para investigar o comportamento celular e interações. Este método permite a visualização de divisão celular NG2 e os passos que levam à diferenciação de oligodendrócitos, enquanto permitindo uma análise detalhada da região, dependement células NG2 e oligodendrócitos heterogeneidade funcional. Esta é uma técnica poderosa que pode ser utilizada para investigar os sinais intrínsecas e extrínsecas que influenciam estas células ao longo do tempo em um ambiente celular que se assemelha ao que se encontra in vivo.
Introdução
Culturas fatia Organoytpic do sistema nervoso central têm provado ser extremamente útil para o estudo do neurônio e da biologia de células gliais em um sistema semiintact 1-4. Estas culturas são relativamente simples de adoptar e reter muitos benefícios de culturas dissociadas de células primárias, tal como a manipulação do ambiente extracelular e de fácil acesso para a imagem de células vivas repetida a longo prazo e registos electrofisiolicos 5-9. Além disso, as culturas de fatias manter citoarquitetura tecido 3-dimensional, conectividade neuronal regional, e a maioria dos tipos de células principais estão presentes no sistema. Estas proprieda....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos com animais está seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Connecticut.
NOTA: Para estas experiências constitutivas NG2cre 18 (JAX # 008533) e induzível NG2creER 16 (JAX # 008538) camundongos transgênicos cruzou para Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP repórter 20 (JAX # 006148) linhas, respectivamente, foram utilizados a imagem células NG2 e seus descendentes. Para imagem oligodendrócitos maduros, foram utilizados PLPDsRed camundongos transgênicos 21. Para a sobrevivência consistente, as fatias pode ser isolado a pa....
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Resultados
Exemplos de dados representativos são dadas abaixo que foram obtidos utilizando culturas fatia de ambos parte frontal do cérebro e cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linhas de camundongos transgênicos. Células NG2 pode ser trabalhada ao longo de dias em fatias do cérebro anterior e cerebelo (Figura 1B-D, Vídeo 1) e o fenótipo destas células pode ser determinado após fixação e coloração imunológica com anticorpos NG2 e CC1 (Figura 1E). Além de viver de imagem, a prolife.......
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Discussão
Mielinização no sistema nervoso central é essencial para a comunicação neuronal e sobrevivência eficiente axonal 22. Células NG2 gerar continuamente oligodendrócitos myelinating para a idade adulta, mantendo uma população residente na maioria das regiões do cérebro 16,23 - 25. Alguns mecanismos genéticos e moleculares que regulam a diferenciação destas células foram descritas, mas ainda há muito a ser descoberto. Culturas fatia organot�icas são uma ferramenta conveniente para investigar estes mec.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros conflitantes
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações da National Multiple Sclerosis Society (RG4179 para A.N.), dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH R01NS073425 e R01NS074870 para A.N.) e da National Science Foundation (A.N.). Agradecemos ao Dr. Frank Kirchhoff (Universidade de Saarland, Homburg, Alemanha) por fornecer camundongos transgênicos PLPDsRed. Agradecemos a Youfen Sun por sua ajuda na manutenção da colônia de camundongos transgênicos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank' s Solução salina balanceada | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg / L |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0,4mM |
| Soro de cavalo | Hyclone | SH30074,03 | 25% |
| Titule para pH 7,22 com NaOH, filtre com filtro superior de garrafa e armazene a 4 graus Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anidro) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-glicose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ácido | ascórbicoSigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosina | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filtre com filtro superior de frasco e armazene a 4 graus Celsius, oxigenado com 95%O2 5%CO2 antes de usar | |||
| Outros Reagentes e Suprimentos | |||
| 4-hidroxi tamoxifeno (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldeído (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-lisina | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0,1M |
| Metaperiodato de sódio | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0,01M |
| Coelho anti NG2 anticorpo | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Camundongo anti CC1 anticorpo | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Anticorpo anti Ki67 do rato | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Anticorpo do rato anti NeuN | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Anticorpos secundários específicos da espécie | Jackson Immunoresearch | ||
| Soro normal da cabra (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Meio de montagem com DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell inserções de membrana de cultura 0.45μ m tamanho do poro | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Filtros superiores de garrafa | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Etanol | |||
| 95% O2 5% CO2 mistura | |||
| Fosfato tampolado com solução salina (PBS) | |||
| Placas estéreis de seis poços | |||
| Dissecar (hipocampo) ou pesar espátulas | |||
| Picador | |||
| Lâminas de | |||
| Pipetas de transferência descartáveis Placas | |||
| de Petri estéreis de 35mm e 60mm | |||
| Estereomicroscópio | |||
| Fase Invertida Microscópio | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Incubadora | |||
| Microcopa |
Referências
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures f....
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Reimpressões e permissões
