Construção de vapor Chambers usada para expor Ratos ao álcool durante o equivalente a todos os três trimestres de Desenvolvimento Humano

Summary

Nós demonstramos a construção de câmaras de vapor de álcool, utilizando materiais facilmente disponíveis que abrigam simultaneamente seis gaiolas de rato. Descrevemos ainda mais a sua utilização em um modelo do rato de exposição fetal ao álcool equivalente a todos os 3 trimestres de gestação humana. Este paradigma expõe animais durante a gestação e pós-natal dias 1-12.

Abstract

A exposição ao álcool durante o desenvolvimento pode resultar em uma constelação de anormalidades morfológicas e comportamentais que são conhecidos coletivamente como Transtornos do Espectro Fetal Álcool (FASDs). No final mais grave do espectro é a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), caracterizada por retardo de crescimento, dysmorphology craniofacial e déficits neurocomportamentais. Os estudos com modelos animais, incluindo os roedores, elucidaram muitos mecanismos celulares e moleculares envolvidas na patofisiologia da FASDs. Administração de etanol para roedores grávidas tem sido utilizado para modelar a exposição humana durante os primeiros e segundo trimestres da gravidez. Terceiro trimestre o consumo de etanol em humanos foi modelado usando roedores neonatais. No entanto, alguns estudos com roedores têm caracterizado o efeito da exposição ao etanol durante o equivalente a todos os três trimestres da gravidez humana, um padrão de exposição que é comum em mulheres grávidas. Aqui, vamos mostrar como construir câmaras de vapor a partir prontamente omateriais btainable que podem acomodar até seis gaiolas mouse padrão. Descrevemos um paradigma de câmara de vapor que pode ser utilizado para modelar a exposição ao etanol, com uma manipulação mínima, durante todos os três trimestres. Os nossos estudos demonstraram que vacas prenhes desenvolveu tolerância metabólica significativa de etanol. No entanto, os ratos neonatal não desenvolveram tolerância metabólica e do número de fetos, peso do feto, placenta peso, número de filhotes / ninhada, número de mortos filhotes / ninhada e peso das crias não foram significativamente afetadas pela exposição ao etanol. Uma vantagem importante deste paradigma é a sua aplicabilidade para estudos com ratinhos geneticamente modificados. Além disso, este paradigma minimiza o manuseio de animais, um grande confundir na pesquisa do alcoolismo fetal.

Introduction

Beber durante a gravidez pode prejudicar o feto, causando alterações persistentes em muitos órgãos e sistemas que diminuem significativamente a qualidade de vida para os indivíduos afetados e suas famílias. Estima-se que aproximadamente 10-30% das mulheres bebem durante a gravidez em os EUA, com 1-8% de beber em padrão binge ^1,2. A gama de efeitos produzidos pela exposição ao etanol durante o desenvolvimento fetal é coletivamente conhecido como transtornos do espectro do álcool fetal (FASDs). Estimativas recentes indicam que FASDs são um importante problema de saúde pública, com uma prevalência tão alta quanto 2-5% em os EUA ^3. O mais grave manifestação de FASDs é Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), a qual é caracterizada por retardo de crescimento, anormalidades craniofaciais, e os déficits neurocomportamentais, incluindo dificuldades de aprendizagem. A prevalência da FAS foi estimada em 0,2-0,7% em os EUA ^3. Os tratamentos atualmente disponíveis para FASDs são apenas parcialmente eficazese desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é limitado pela má compreensão das bases celulares e moleculares do complexo espectro de transtornos.

Os dados dos defeitos congénitos Nacionais Prevention Study (NBDPS) indicam que as mulheres grávidas mais comumente beber durante o 1 ^º trimestre, antes de ter sido detectado a gravidez, seguido de abstinência durante as fases posteriores de gestação ^2. O NBDPS também descobriram que o segundo padrão mais comum de consumo de etanol durante a gestação envolve beber em todos os trimestres da gravidez ^2. As razões para isso incluem a falta de conhecimento sobre os efeitos potencialmente nocivos da exposição fetal etanol (mesmo em doses baixas), o acesso limitado a cuidados de pré-natal, história positiva para transtornos neuropsiquiátricos e abuso ou dependência de álcool ^4. Curiosamente, o NBDPS relatado que o terceiro padrão mais comum de consumo envolvido abstinência durante a 1 <sup> º e 2 º trimestres seguidos de ^nd consumo durante o 3 ^º trimestre, quando é frequentemente assumido que o consumo é seguro porque organogênese tem sido quase concluída. No entanto, o 3 ^º trimestre é um período de alta susceptibilidade a danos no sistema nervoso induzida por etanol, porque este é um período em que circuitos neuronais sofrer profundo refinamento ^2. O NBDPS identificou também outros padrões, menos frequentes do consumo de álcool que ocorrem durante a gravidez, incluindo o consumo ao longo do 1 ^º e 2 ^º trimestres seguidos de ^nd abstinência durante o 3 ^º trimestre ^2.

Numa tentativa de modelar os diferentes padrões de consumo de etanol observados em mulheres grávidas, um número de paradigmas de exposição etanol desenvolvimento têm sido estabelecida utilizando diversas espécies de animais, com ratos e ratinhos, sendo ^5,6 o mais comum. A duração da gestação nesses animais tipicamente lasst cerca de 3 semanas, o que corresponde à 1 ^ª e 2 ^ª trimestres de gravidez humana. Muitos estudos com roedores têm avaliado o impacto de várias doses e padrões de exposição ao etanol durante este período. Exemplos dos métodos frequentemente utilizados para administrar o etanol para ratinhos e ratos fêmeas grávidas incluem a administração através de dietas líquidas ^7,8, adição de etanol para a água potável ^9,10, a ingestão voluntária de soluções adoçadas com sacarina ^11, sonda gástrica ^12, a inalação do vapor ¹³ , e subcutânea ou intraperitoneal ^14. Os resultados destes estudos foram recapitulado vários dos défices observados em humanos com FASDs, demonstrando que a exposição durante as fases iniciais da gravidez é suficiente para danificar os circuitos neuronais em todo o cérebro (revisão em ^6,15).

As experiências com roedores também têm demonstrado que a exposição durante o equivalente a 3 ^ª </sup> Trimestre de gravidez humana, o que corresponde aproximadamente aos primeiros 1-2 semanas de vida pós-natal em ratos e camundongos, podem comprometer significativamente o desenvolvimento do cérebro. Exposição durante este período foi modelado através da administração de etanol em ratos ou camundongos neonatais. O etanol tem sido administrada a estes animais, usando uma variedade de métodos, incluindo a alimentação por gastrostomia em animais criados artificialmente ^16-18, intubação intragástrica ^19, a injecção subcutânea ^{de 20,} e a inalação do vapor ^21,22. Estes estudos demonstraram de forma convincente que o crescimento do cérebro jorro é um período de elevada vulnerabilidade para os efeitos no desenvolvimento de etanol ^6.

Como mencionado acima, beber durante todos os trimestres da gravidez é um padrão comum de consumo de etanol em mulheres ^2. No entanto, comparativamente, poucos estudos avaliaram o impacto deste padrão de exposição utilizando modelos animais. Alguns destes estudos tomaram advantage de animais de grande porte, onde o 3 ^rd trimestre equivalente ocorre no útero, em vez de o período neonatal, como no caso de ratazanas e ratos. Estes modelos animais incluem primatas não humanos, ovelhas ^{23,24 25-27.} No entanto, estes modelos animais, não têm sido amplamente utilizados em FASDs pesquisa, em parte, por causa do custo elevado e a necessidade de instalações de cuidados especializados. Roedores têm sido mais comumente usado para caracterizar o efeito da exposição ao etanol tudo trimestre sobre o desenvolvimento fetal ^5. As cobaias foram particularmente vantajosa a este respeito dado o seu amplo desenvolvimento pré-natal e semelhanças na maturação do cérebro ao dos humanos ^28,29. Com cobaias, foi possível caracterizar o efeito da exposição ao etanol, no útero, que inclui o período de desenvolvimento equivalente ao humano ^3o trimestre. O custo relativamente alto destes animais, bem como a duração relativamente longa da gravidez(~ 67 dias), tem limitado o seu uso a poucos laboratórios que trabalham com FASDs pesquisa.

Devido ao seu uso custo-eficácia e ampla na pesquisa biomédica, os pesquisadores usaram ratos para modelar a exposição ao etanol durante todos os trimestres da gravidez. Em estudos iniciais, os ratos foram expostos durante a gravidez através de dietas líquidas, seguido por administração de etanol através de gastrotomia para criados artificialmente recém-nascidos (dia pós-natal (P) 1-10), resultando em níveis de etanol no sangue de pico (BEC) nas barragens de 0,08 g / dl e em que os filhotes de 0,16 g / dl. Este paradigma causou alterações duradouras na mielinização do nervo óptico e redução do número de fibras de glia Bergmann no cerebelo ^30-32. Da mesma forma, Maier e colaboradores usando condições de criação artificiais administrados etanol para barragens de ratos grávidas de forma binge-como via intubação intragástrica seguido por administração neonatal durante parte do 3 ^º trimestre equivalente (P4-9) ^33,34. PEAK BECs maternos e filhote foram de 0,3 g / dl, tanto gestacional dia 20 e P6. Este paradigma exposição todos trimestre resultou em atraso de crescimento, que foi significativamente maior do que a observada nos filhotes expostos durante períodos determinados de gestação ^33. Além disso, os ratos expostos a etanol durante o equivalente para todos os trimestres exibiram uma redução no número de Purkinje do cerebelo e células de grânulos que era maior do que o observado em animais expostos durante outros períodos de ^34. As reduções no número de células do hipocampo também foram relatados com esse paradigma, mas esses efeitos parecem ser principalmente uma conseqüência da exposição durante o 3 ^º trimestre equivalente ^35. Um método que envolve a administração de etanol via intragástrica gavagem para ambas as ratas grávidas e ratinhos neonatais também tem sido usado para modelar toda a exposição trimestre ^36. Este método, o qual originou CEBs de 0,13 g / dl nas barragens (dia 17 de gestação) e 0,24 g / dl em crias de P6, lon induzidaalterações duração g nos níveis de neurotransmissores monoamina no hipocampo e no hipotálamo, e aumento da expressão de DNA metiltransferases e metil CpG proteína 2 de ligação no hipocampo ^37,38. Usando um paradigma de exposição semelhantes (BEC = 0,14-0,2 g / dl em barragens e 0,2 g / dl em crias), Gil-Mohapel et al. ³⁹ detectado um aumento no número de novos neurónios imaturos no giro dentado de ratos adultos que pode representar um mecanismo compensatório a lesão neuronal induzida por etanol ou uma alteração na maturação dos neurónios adultos nascidos. Os investigadores também têm tentado modelar toda a exposição ao etanol trimestre expondo barragens via dietas líquidas ou água potável durante a gravidez e lactação ^9,40. No entanto, a utilidade de expor os filhotes através do leite da mãe é limitado porque normalmente resulta em baixos BECs filhote (por exemplo, ,002-,05 g / dl; ^41,42).

Os ratinhos foram também utilizados extensvamente para caracterizar os efeitos da exposição ao etanol de desenvolvimento. Este modelo animal compartilha muitos dos pontos fortes descritos acima para o modelo animal de ratos, com a vantagem adicional de que muitas linhagens de camundongos geneticamente modificados estão disponíveis ^5. Ratos têm sido usados ​​com sucesso para caracterizar os efeitos do etanol durante o 1 ^º, 2 ^º ou 3 ^º trimestres de gestação ^43,44. No entanto, o impacto de qualquer exposição trimestre nestes animais não foi bem caracterizado por ser tecnicamente mais difícil para expor os ratos durante o equivalente a todos os trimestres da gravidez humana. Por exemplo, a criação e artificial por sonda gástrica, que têm sido utilizados com sucesso em ratos, requerem procedimentos mais especializados em ratos ^45. Ao melhor de nosso conhecimento, apenas um estudo até à data tem tentado estudar o efeito de qualquer exposição etanol trimestre utilizando camundongos; esses animais foram expostos a solução de etanol em água potável during gravidez e lactação ^46. BECs maternas foram 0,07 g / dl e filhote BECs não foram determinadas, mas espera que seja uma fração daqueles em barragens.

Aqui, descrevemos um novo modelo de exposição ao etanol tudo trimestre de ratos onde o álcool é administrada aos dois barragens grávidas e recém-nascidos através de câmaras de inalação de vapor. Câmaras de vapor foram construídos com base em um projeto anterior ^47. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre como construir as câmaras de inalação e executar os procedimentos de exposição. Nós também fornecemos informações sobre as CEBs que podem ser alcançados e do impacto da exposição na sobrevivência das crias e crescimento.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade do Novo México de Ciências da Saúde-Centro Animal Care Institucional e Comitê de uso. 1. Montagem de câmara de vapor Corte as folhas de policarbonato com uma serra circular ou quebra-cabeças para as dimensões fornecidas no vídeo para a parte superior, inferior, frontal, traseira, laterais e porta (Figura 1 e Tabela 1). Com uma serra circular ou de serra de vaiv?…

Representative Results

Figura 2A mostra que ambos os ratos grávidas e filhos neonatal foram expostos a concentrações de vapor de etanol relativamente estáveis ​​nas câmaras. Estas variaram entre 4-6 g / dl. Figura 2B mostra as CEBs obtidos nas ratas grávidas como uma função do tempo. CEBs foram medidos usando uma enzima álcool desidrogenase padrão baseado ensaio 48. No G5, BEC rapidamente aumentou para ~ 60 mM de 2 horas após o início da exposição e atingiu um pico no final do per…

Discussion

Aqui, descrevemos em detalhes os métodos para a construção de câmaras de inalação de vapor. Os materiais e as ferramentas necessárias para a construção das câmaras estão prontamente disponíveis a partir de uma série de fornecedores comerciais e os passos para a construção das câmaras são relativamente simples. O sistema que nós descrevemos aqui não contém válvulas de retenção em linha para evitar o refluxo e mixagem. Não fomos capazes de medir qualquer etanol detectáveis ​​no ar apenas câma…

Materials

Item	Company	Cat #	Qty
Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24"	McMaster-Carr	8574K23	10
Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h	McMaster-Carr	93085K67	10ft
Weld-on #16	McMaster-Carr	7515A11	3
Piano hinge 12" long	McMaster-Carr	1658A11	2 x 1ft
Hold-down toggle clamps standard	McMaster-Carr	5126A26	8
PEX tubing 1/2"	McMaster-Carr	51275K88	10ft
Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10	McMaster-Carr	5463K608	1
Barbed plug fitting (Black) Pkg 10	McMaster-Carr	5462K79	1
Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10	McMaster-Carr	5463K596	1
3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe	McMaster-Carr	5463K851	1
Phillips Machine screw 4-40	McMaster-Carr	91772A112	1
Machine screw hex nut 4-40	McMaster-Carr	90480A005	1
Panel-mount flowmeter 2-20	McMaster-Carr	41945K76	3
FLASK, FILTER 1000ML 6/PACK	VWR	89001-800	2
Precision Seal Septa	VWR	89084-490	1
VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole	VWR	59581-367	1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50'	VWR	89068-556	1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50'	VWR	89068-502	1
Aerator Stone P2120	VWR	32573-007	1
3/8" T-connectors Pk of 20	VWR	46600-060	1
VWR Disconnectors tapered Pk of 10	VWR	46600-110	1
3/8 Hose Barb valved in-line coupling	Colder Products Company	HFCD17612	1
Air pump medium capacity	LMI Manufacturers	DB60L	1
Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H	Global industrial	T9A990135	1
Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel	Global industrial	T9A500591	1
Breathalyzer Alco-Sensor III	Intoximeters, Inc.	ASIII	1 Item Company Cat # Qty Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" McMaster-Carr 8574K23 10 Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h  McMaster-Carr 93085K67 10ft Weld-on #16 McMaster-Carr 7515A11 3 Piano hinge 12" long McMaster-Carr 1658A11 2 x 1ft Hold-down toggle clamps standard McMaster-Carr 5126A26 8 PEX tubing 1/2" McMaster-Carr 51275K88 10ft Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K608 1 Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5462K79 1 Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K596 1 3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe McMaster-Carr 5463K851 1 Phillips Machine screw 4-40 McMaster-Carr 91772A112 1 Machine screw hex nut 4-40 McMaster-Carr 90480A005 1 Panel-mount flowmeter 2-20 McMaster-Carr 41945K76 3 FLASK, FILTER 1000ML 6/PACK VWR 89001-800 2 Precision Seal Septa VWR 89084-490 1 VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole VWR 59581-367 1 TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' VWR 89068-556 1 TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' VWR 89068-502 1 Aerator Stone P2120 VWR 32573-007 1 3/8" T-connectors Pk of 20 VWR 46600-060 1 VWR Disconnectors tapered Pk of 10 VWR 46600-110 1 3/8 Hose Barb valved in-line coupling Colder Products Company HFCD17612 1 Air pump medium capacity LMI Manufacturers DB60L 1 Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H Global industrial T9A990135 1 Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel Global industrial T9A500591 1 Breathalyzer Alco-Sensor III Intoximeters, Inc. ASIII 1