मिलकर उच्च दबाव बर्फ़ीली और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संयंत्र के ऊतकों के त्वरित रुक प्रतिस्थापन
Summary
Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
Abstract
1940 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) जैविक सामग्री के अति उच्च संकल्प छवियों के साथ जीव प्रदान किया गया है के बाद से. फिर भी, क्योंकि यह भी artifact मुक्त नमूनों की तैयारी में अनुभव है कि मांग श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रोटोकॉल का, मंदिर एक उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक नहीं माना जाता है. मंदिर के लिए पारंपरिक नमूना तैयार सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण के लिए रासायनिक fixatives इस्तेमाल किया. उच्च दबाव ठंड जिससे सेलुलर फैटी की अखंडता के लिए हानिकारक है जो बर्फ के गठन, सीमित, बहुत तेजी से ठंडा दरों का उत्पादन करने के लिए उच्च दबाव के तहत जैविक नमूने का cryofixation है. उच्च दबाव ठंड और फ्रीज प्रतिस्थापन वर्तमान में मंदिर के लिए राल वर्गों में उच्चतम गुणवत्ता आकृति विज्ञान के उत्पादन के लिए चुनाव के तरीके. इन विधियों सामान्य रूप से पतली वर्गों के मंदिर के लिए परम्परागत प्रसंस्करण से जुड़े कलाकृतियों को कम. Cryofixation बाद नमूने में जमे हुए पानी तरल के साथ बदल रहा हैकम तापमान पर कार्बनिक विलायक, एक प्रक्रिया फ्रीज प्रतिस्थापन बुलाया. रुक प्रतिस्थापन आमतौर पर समर्पित, महंगे उपकरण में कई दिनों में किया जाता है. हाल ही में एक नवाचार के बजाय हमेशा की तरह दो दिनों की, प्रक्रिया तीन घंटे में पूरा होने की अनुमति देता है. यह आमतौर पर घुसपैठ और सेक्शनिंग पहले epoxy रेजिन में एम्बेड भी शामिल है कि नमूना तैयार करने के कई दिन और उसके बाद है. यहाँ हम संयंत्र नमूना निर्धारण घंटे के भीतर पूरा किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है कि उच्च दबाव ठंड और त्वरित फ्रीज प्रतिस्थापन संयोजन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल आसानी से अन्य ऊतकों या जीवों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. संयंत्र के ऊतकों क्योंकि पानी की बर्फ से मुक्त ठंड में बाधा कि वातित रिक्त स्थान और पानी से भरे रिक्तिकाएं की उपस्थिति की विशेष चिंता का विषय है. इसके अलावा, रासायनिक निर्धारण की प्रक्रिया के ऊतकों के भीतर गहरे तक रसायनों का प्रवेश impeding सेल दीवारों की वजह से पौधों में विशेष रूप से लंबा है. संयंत्र के ऊतकों इसलिए खास हैंularly चुनौतीपूर्ण, इस प्रोटोकॉल विश्वसनीय है और उच्चतम गुणवत्ता के नमूनों का उत्पादन लेकिन.
Introduction
सेल फैटी की हमारी ज्ञान कुछ नैनोमीटर 1 की श्रेणी में विवरण को हल कर सकते हैं जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, मुख्य रूप से आता. नमूना तैयार करने के लिए समय लेने वाली और श्रमसाध्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता है, और व्यवसायी से कुछ विशेषज्ञता की मांग के रूप में संकल्प मंदिर में इतनी शक्तिशाली होने के बावजूद, उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं माना जाता है. नमूने के पारंपरिक निर्धारण राल में एम्बेड और फिर तो भारी धातुओं के साथ दाग रहे हैं कि अति पतली वर्गों का उत्पादन करने के लिए सेक्शनिंग, निर्जलीकरण शामिल है कि आगे की प्रक्रिया से पहले aldehydes और आज़मियम tetroxide का उपयोग जोड़ रखा है. हालांकि, यह रासायनिक निर्धारण अंततः कई सेलुलर डिब्बों 2 को प्रभावित करने वाले झिल्ली प्रोटीन एकत्रीकरण और लिपिड 1 की हानि, और परिवर्तन सहित कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं कि जाना जाता है. इन कलाकृतियों को काफी हद तक कमरे के तापमान 3, 4, 5 में निर्धारण और निर्जलीकरण की धीमी दर के लिए जिम्मेदार हैं.
<p class="Jove_content"> उच्च दबाव ठंड (HPF) द्वारा Cryofixation रासायनिक निर्धारण की वजह से कलाकृतियों के सबसे बचा जाता है. cryofixation का सिद्धांत यह 7. HPF एक कम हो जाती है,, 20 डिग्री से पानी की हिमांक कम करती है बर्फ क्रिस्टल की nucleation और विकास धीमा और सेलुलर घटक अनिवार्य रूप से 6 स्थिर रहे हैं तो एक जैविक नमूने में पानी की चिपचिपाहट बढ़ जाती है मिलीसेकेंड में बहुत ही उच्च दबाव (210 एमपीए या 2,100 बार) के तहत तरल नाइट्रोजन की है कि नमूना के तापमान,. जब ठीक से किया HPF सेल फैटी के लिए बड़ी क्षति पैदा कर सकता है कि बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचाता है. HPF जैविक विलेय 7 की विशिष्ट सांद्रता में 100-200 माइक्रोन मोटाई के नमूनों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HPF, जैसे 1, 7, 8 अंतर्निहित कई भौतिकी पर समीक्षा और सिद्धांत होते हैं.HPF के बाद, नमूने -90 और के लिए कम तापमान पर (-78.5 डिग्री सेल्सियस incubated हैंआम तौर पर कुछ दिनों के लिए आज़मियम tetroxide तरह तरल जैविक विलायक युक्त रासायनिक fixatives, की उपस्थिति में सी), # 176. इस कम तापमान पर, नमूने में पानी कार्बनिक विलायक, आमतौर पर एसीटोन या मेथनॉल 1, 9 की जगह है. इस प्रकार, इस प्रक्रिया को कहा जाता है फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस). नमूना फिर धीरे धीरे गरम है और इस समय के दौरान आमतौर पर आज़मियम tetroxide और uranyl एसीटेट 9 के साथ, तय हो गई है. कम तापमान पर crosslinking 1 स्थिर रहे हैं कि अणुओं फिक्सिंग का लाभ दिया है. एफएस इसलिए यह सुधार ultrastructural संरक्षण में यह परिणाम विशेष रूप से कमरे के तापमान पर पारंपरिक रासायनिक निर्धारण द्वारा तय की उन की तुलना में बेहतर गुणवत्ता, प्रतिजनकता के बेहतर संरक्षण के नमूनों का उत्पादन और अपार सेलुलर घटकों 10, 11 के नुकसान को कम किया.
अधिकांश एफएस आम तौर पर कई दिनों तक लंबे समय अवधि में किया जाता है. यह विशेष रूप से Tru हैपौधों के नमूने 12, 13, 14 के लिए ई. मैकडॉनल्ड्स और वेब द्वारा विकसित हाल ही में एक प्रोटोकॉल बहुत कुछ घंटे 15 करने के लिए कई दिनों से एफएस के लिए समय कम कर देता है. सुपर त्वरित एफएस में (SQFS) नमूने 90 मिनट में कार्रवाई कर रहे हैं, जबकि उनके त्वरित फ्रीज प्रतिस्थापन (QFS) प्रक्रिया में, एफएस, 3 घंटे से अधिक किया जाता है. इन विधियों द्वारा निर्मित नमूनों की गुणवत्ता पारंपरिक एफएस प्रोटोकॉल से मिले उन लोगों के बराबर है. हम HPF के बाद संयंत्र के नमूने के बहाव के प्रसंस्करण के लिए QFS प्रोटोकॉल को अपनाया है. QFS और SQFS बजाय महंगा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एफएस मशीनों की आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करें, क्योंकि यह समय है लेकिन यह भी पैसे न केवल बचाने के लिए साबित हो गया है.
संयंत्र के ऊतकों अक्सर मंदिर के लिए तैयार करने के लिए बहुत चुनौती दे रहे हैं. औसत पर, पादप कोशिकाओं बैक्टीरियल या पशु कोशिकाओं या तो तुलना में बड़ा है. हाइड्रोफोबिक मोमी छल्ली, मोटी सेल दीवारों, कार्बनिक अम्ल, हाइड्रोलिसिस और phenolic सी युक्त बड़े पानी से भरे रिक्तिकाएं की उपस्थितिompounds कि कुल सेल मात्रा 16 से 90% तक पर कब्जा कर सकते हैं, और वातित रिक्त स्थान की उपस्थिति गंभीर रूप से प्रणाली 17 की गर्मी चालकता कम हो जाती है. इसके अलावा, पौधों के मामले में, नमूना मोटाई लगभग हमेशा 20 माइक्रोन, रासायनिक निर्धारण के प्रयोग के लिए सीमा से अधिक है. इन मोटाई में पानी की कम गर्मी चालकता नमूना के केंद्र में एक ठंड की दर से अधिक -10,000 डिग्री सेल्सियस / सेक रोकता है. उस दर हानिकारक हेक्सागोनल बर्फ गठन (एक कम घनत्व के साथ बर्फ क्रिस्टल और बड़ा से 10 से 15 एनएम) से बचने के लिए आवश्यक है 8. साथ में, नमूना और बाद एफएस के दोनों उचित ठंड के लिए इन वर्तमान चुनौतियों. बहरहाल, cryofixation संयंत्र नमूने फिक्सिंग के लिए सबसे अच्छा तरीका है. यहाँ संयंत्र के ऊतकों के नमूनों की HPF-QFS के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. यह मॉडल प्रजातियों Arabidopsis thaliana पर केंद्रित है, लेकिन यह भी निकोटियाना benthamiana के साथ प्रयोग किया गया है. ठेठ परिणामों HPF-QFS सा है कि उत्पादन का प्रदर्शनसमय का एक अंश में पारंपरिक HPF-FS के लिए तुलनीय गुणवत्ता के mples. उचित समायोजन के साथ, इस प्रोटोकॉल भी अन्य अपेक्षाकृत मोटी जैविक नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की सफलता उपयोगकर्ता पर काफी निर्भर करता है. सबसे पहले, उन्नत तैयारी के लिए सभी आवश्यक सामग्री आसानी से उपलब्ध है और एक पूरी HPF-QFS रन पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में कर रहे हैं …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यूसी बर्कले के डॉ केंट मैकडॉनल्ड्स की दया और उदारता काफी सराहना की है. हम बहुत उपयोगी सुझाव के लिए एक गुमनाम समीक्षक धन्यवाद. Burch स्मिथ प्रयोगशाला टेनेसी विश्वविद्यालय से शुरू हुआ धन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
Referências
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