Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Sinds 1940 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is het verstrekken van biologen met ultra-hoge resolutie beelden van biologische materialen. Maar omdat bewerkelijke en tijdrovende protocollen vereisen ook ervaring bereiding van artefactvrij monsters TEM wordt niet als een gebruiksvriendelijke techniek. Traditionele monstervoorbereiding voor TEM gebruikt chemische fixatives om cellulaire structuren te behouden. Hogedruk invriezen is Cryofixatie biologische monsters onder hoge druk zeer snel afkoelsnelheid produceren, waardoor ijsvorming, hetgeen nadelig is voor de integriteit van cellulaire ultrastructuur beperken. Hoge druk invriezen en vries substitutie zijn de methoden van de keuze voor het produceren van de hoogste kwaliteit morfologie in harssecties voor TEM. Deze methoden minimaliseren van de artefacten normaal in verband met conventionele verwerking voor TEM van dunne secties. Na Cryofixatie het bevroren water in het monster wordt vervangen door vloeistoforganisch oplosmiddel bij lage temperaturen, een proces genaamd freeze substitutie. Freeze substitutie wordt meestal uitgevoerd over meerdere dagen in speciale, dure apparatuur. Een innovatie kan het proces drie uur te vullen, in plaats van de gebruikelijke twee dagen. Dit wordt meestal gevolgd door een aantal dagen van monstervoorbereiding dat infiltratie en inbedding in epoxyharsen voor het snijden omvat. Hier presenteren we een protocol combineert hoge druk invriezen en quick freeze substitutie waarmee planten monster fixatie kan worden bereikt binnen een paar uur. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het werken met andere weefsels of organismen. Plantenweefsels zijn van bijzonder belang vanwege de aanwezigheid van beluchte ruimtes en watergevulde vacuolen die ijsvrij bevriezing van water belemmeren. Bovendien is het proces van chemische fixatie is bijzonder lang in planten door celwanden de penetratie van de chemische belemmeren om diep in de weefsels. Plantaardige weefsels zijn daarom particularly uitdagend, maar dit protocol is betrouwbaar en produceert monsters van de hoogste kwaliteit.

Introduction

Onze kennis van cel ultrastructuur voornamelijk afkomstig elektronenmicroscopie, die informatie kan oplossen in het bereik van enkele nanometers ^1. Ondanks het feit dat zo krachtig in resolutie TEM wordt niet beschouwd als gebruiksvriendelijk, als monstervoorbereiding vereist tijdrovend en moeizaam protocollen, en vereist enige expertise van de behandelaar. Traditionele fixatie van de monsters is gecombineerd gebruik van aldehyden en osmiumtetroxide vóór verdere verwerking die uitdroging omvat, inbedding in hars en vervolgens snijden om ultra-dunne secties die vervolgens worden gekleurd met zware metalen te produceren. Het is echter bekend dat chemische fixatie artefacten waaronder eiwit aggregatie en verlies van lipiden ¹ en wijzigingen membranen die uiteindelijk invloed verscheidene cellulaire compartimenten ² kan produceren. Deze artefacten zijn grotendeels toegeschreven aan de trage fixatie en dehydratatie bij kamertemperatuur ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixatie door hoge druk invriezen (HPF) vermijdt meeste artefacten veroorzaakt door chemische fixatie. Het principe van Cryofixatie is dat het verlaagt het vriespunt van water van 20 graden, vertraagt ​​de nucleatie en groei van ijskristallen en verhoogt de viscositeit van water in een biologisch monster zodat celbestanddelen wezen geïmmobiliseerd ^{6, 7.} HPF afneemt a temperatuur monster met die van vloeibare stikstof, onder zeer hoge druk (210 MPa of 2.100 bar) in milliseconden. Wanneer goed uitgevoerd HPF voorkomt vorming van grote ijskristallen die grote schade aan cel ultrastructuur kan veroorzaken. HPF kan worden gebruikt om monsters van 100-200 urn dikte bepalen op typische concentraties van biologische opgeloste stoffen ^7. Er zijn tal van recensies over de natuurkunde en de beginselen die ten grondslag liggen HPF, bijvoorbeeld ^{1, 7, 8.}

Na HPF worden monsters geïncubeerd bij lage temperatuur (-78.5 ° C tot -90 &# 176, C) in de aanwezigheid van vloeibaar organisch oplosmiddel dat chemische fixatieven zoals osmiumtetroxide, meestal een paar dagen. Bij deze lage temperatuur wordt het water in het monster vervangen door het organische oplosmiddel, meestal aceton of methanol ^{1, 9.} Daarom is deze werkwijze genoemd freeze substitutie (FS). Het monster wordt vervolgens geleidelijk verwarmd en gedurende deze tijd wordt vastgesteld, meestal met osmiumtetroxide en uranyl acetaat ^9. Verknoping bij lage temperaturen heeft het voordeel vaststelling moleculen die geïmmobiliseerd ^1. FS levert dus monsters van superieure kwaliteit in vergelijking met die van conventionele chemische fixatie bij kamertemperatuur vast, in het bijzonder het resulteert in een verbeterde ultrastructureel behoud, beter behoud van antigeniciteit en minder verlies van ongebonden cellulaire componenten ^{10, 11.}

De meeste FS wordt over langere tijdsperioden uitgevoerd typisch tot enkele dagen. Dit is vooral true voor planten monsters ^{12, 13, 14.} Een recent protocol ontwikkeld door McDonald en Webb vermindert de tijd voor FS van enkele dagen tot enkele uren ^15. In hun snelvriesstrip substitutie (QFS) procedure, wordt FS over 3 uur uitgevoerd, terwijl in de supersnelle FS (SQFS) monsters worden verwerkt in 90 minuten. De kwaliteit van de monsters die door deze werkwijzen vergelijkbaar met die aan traditionele FS protocollen. We hebben de QFS protocol voor verdere verwerking van plantaardige monsters na HPF aangenomen. Het is gebleken dat niet alleen tijd, maar ook geld, zoals QFS en SQFS gebruiken gemeenschappelijke labapparatuur plaats van de dure handel verkrijgbare FS machines.

Plantenweefsels zijn vaak zeer moeilijk te bereiden TEM. Gemiddeld plantencellen groter dan zowel bacteriële of dierlijke cellen. De aanwezigheid van hydrofobe wasachtige cuticula, dikke celwanden, groot-water gevulde vacuolen bevatten organische zuren, hydrolasen en fenolische compounds die mogen nemen tot 90% van het totale celvolume ^16, en de aanwezigheid van beluchte ruimtes ernstig vermindert warmtegeleidbaarheid van het systeem ^17. Verder, in het geval van planten, de monsterdikte bijna altijd meer dan 20 urn, de limiet voor gebruik van chemische fixatie. Bij deze dikten, de lage warmtegeleidbaarheid van water voorkomt bevriezing percentage meer dan -10.000 ° C / sec in het midden van het monster. Dit percentage is nodig om schadelijke zeshoekige ijsvorming (ijskristallen met een lagere dichtheid en groter dan 10 tot 15 nm) te vermijden ^8. Samen vormen deze huidige uitdagingen voor zowel de juiste vriespunt van het monster en de daaropvolgende FS. Toch Cryofixatie is de beste methode voor het bevestigen van planten monsters. Hier een protocol voor de HPF-QFS van plantaardige weefselmonsters wordt gepresenteerd. Het richt zich op het model soort Arabidopsis thaliana, maar is ook gebruikt met Nicotiana benthamiana. De typische resultaten tonen aan dat HPF-QFS produceert samples van vergelijkbare kwaliteit traditionele HPF-FS in een fractie van de tijd. Met de juiste aanpassingen kan dit protocol ook voor andere relatief dikke biologische monsters.

Protocol

OPMERKING: De QFS procedure vereist uiterste zorgvuldigheid en voorzichtigheid door de gebruiker en wij deze veiligheidsmaatregelen benadrukken hier als voorzorgsmaatregelen en opmerkingen, indien van toepassing. 1.Voorbereiding voor HPF Run Vóór het begin van monstervoorbereiding, zet de hoge druk vriezer volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: De HPF eenheid die wordt gebruikt in dit protocol is een Wohlwend Compact 02-eenheid (Figuur 1A), e…

Representative Results

Onderstaande resultaten zijn verkregen met behulp van een Wohlwend Compact 02 voor HPF (figuur 1A). Een groot voordeel van dit instrument is het gemak van het gebruik van het model dragers en de houders ervan. Bij het ​​gebruik van andere instrumenten, McDonald raadt twee gebruikers de monstervoorbereiding en HPF, men moet uitvoeren voorbereiding van de monsters en de andere doet het invriezen en transfer naar de FS cryovials 9. De Wohlwend monsterdragers en houder is eenvoudig genoeg voo…

Discussion

Het succes van het protocol hier gepresenteerde sterk afhankelijk van de gebruiker. Eerst wordt geavanceerde voorbereiding nodig om ervoor te zorgen dat alle benodigde materialen zijn direct beschikbaar en in voldoende hoeveelheid om een ​​hele HPF-QFS run te voltooien. Ten tweede moet de gebruiker sneller werken, overgang van stap tot stap op efficiënte wijze dat sample handling minimaliseert, waardoor veranderingen in de natieve toestand van het weefsel te minimaliseren. Zodra monsters worden ingevroren en voorda…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs