Mutation priser i unga Saccharomyces cerevisiae-celler mäts genom fluktuations- tester används för att förutsäga mutationsfrekvenser för moderceller av olika replikativa åldrar. Magnetisk sortering och flödescytometri används sedan för att mäta de faktiska mutationsfrekvenser och ålder på moderceller för att identifiera eventuella avvikelser från förutsagda mutationsfrekvenser.
Saccharomyces cerevisiae har varit en utmärkt modellsystem för att undersöka mekanismer och konsekvenser av genomet instabilitet. Information som erhålls från denna jäst modell är relevant för många organismer, inklusive människor, eftersom DNA-reparation och DNA-skada responsfaktorer är väl konserverad över olika arter. Emellertid S. cerevisiae har ännu inte använts för att till fullo ta itu med om graden av ackumulera mutationer förändringar med ökande replika (mitotiska) ålder på grund av tekniska begränsningar. Till exempel mätningar av jästreplika livslängd genom mikromanipulation innebära mycket små populationer av celler som förbjuder upptäcka sällsynta mutationer. Genetiska metoder för att berika för moderceller i populationer genom att inducera död dotterceller har utvecklats, men populationsstorlekar fortfarande begränsas av hur ofta slumpmässiga mutationer som äventyrar urvalssystemen uppstår. Den nuvarande protokollet utnyttjar magnetisk sorting utanpå märkta jäst moderceller för att få tillräckligt stora populationer av åldrande mor celler att kvantifiera sällsynta mutationer genom fenotypiska val. Mutationshastigheter, mätt genom fluktuations- tester och mutationsfrekvenser först upprättas för unga celler och användes för att förutsäga den frekvens av mutationer i moderceller av olika replikativa åldrar. Mutationsfrekvenser skall sedan bestämmas för sorterade moderceller, och åldern av modercellerna bestäms med användning av flödescytometri genom färgning med ett fluorescerande reagens som detekterar knopp ärr formade på sina cellytor under celldelning. Jämförelse av förutsedda mutationsfrekvenser baserat på antalet celldelningar till frekvenserna experimentellt observerats för moderceller i en given replika ålder kan sedan identifiera om det finns åldersrelaterade förändringar i graden av ackumulerande mutationer. Variationer av denna grundläggande protokoll ger möjlighet att undersöka hur förändringar i specifika genfunktioner ellersärskilda miljöförhållanden mutation ansamling ta itu mekanismerna bakom genomet instabilitet under replika åldrande.
Mikroorganismer, såsom jästen Saccharomyces cerevisiae, är utmärkta modeller för att undersöka mutationshastigheter, men dessa modeller har inte utnyttjats fullt ut för att undersöka en ansamling av mutationer under mitotiska cellernas åldrande. Mutation ackumulering i det nukleära genomet har hypoteser för att bidra till åldrande genom att resultera i progressiv förlust av (eller variation i) genfunktioner 1. Möjligheten att använda ett mikrobiellt system för att studera de mekanismer och konsekvenser av mutations ackumulering under åldrandet kan kraftigt påskynda identifieringen av genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar denna process, på grund av facile genetiska systemen och hur lätt kvantifiera sällsynta fenotypiska förändringar i mikroorganismer. DNA-reparationsfaktorer och DNA skador svars proteiner är väl konserverad över skiftande art 2, och grundläggande likheter i organism åldrande har identifierats för organismer så olika som S. cerevisiae end däggdjur 3, vilket gör det troligt att resultaten från studier i jäst kommer att vara relevant för åldrande i många organismer.
Studier av åldrandet i S. cerevisiae använder sig av två åldrande modeller som mäter kronologiska åldrande eller replika åldrande celler. Kronologisk åldrande kännetecknas av progressiv förlust av livskraft i jäst cellpopulationer som befinner sig i en icke delande tillstånd (stationär fas) på grund av näringsämnen utarmning 3. Den kronologiska åldrande modellen har använts för att visa att mutationer ackumuleras med stigande ålder 4, eftersom stora cellpopulationer är lätta att få tag i denna modell för att utföra fenotypiska val för muterade celler. I det här fallet verkar mutation ackumulering påverkas av tillväxtsignalvägar och oxidativ stress 5, och var och en av dessa faktorer är relevant för förståelsen åldring i flercelliga eukaryoter 3. Den replikativa åldrandet modell utnyttjar den asymmetriska divisipå mellan S. cerevisiae mor och dotter celler för att undersöka åldrandet som sker med successiva cellgenerationer 3. Jäst replika åldrande har ofta mätts genom mikromanipulation av små populationer av mor och dotterceller, eller på senare tid, genom video mikroskopi av små populationer av jästceller i mikroflödessystem enheter 6,7. Begränsade populationsstorlekar gör dessa metoder dåligt lämpad för att undersöka mutation ackumulering under mitotisk åldrande, om inte hel-genomet information inhämtas från enskilda celler eller mycket högfrekventa genetiska förändringar mäts 8. Hel-genomet sekvensering av enskilda celler ger stora datamängder för att utreda mutation ackumulation, men fenotypiska selektionssystem har den viktiga fördelen att den ger en metod att mäta mutationshastigheter för att studera mekanismerna bakom mutation ackumulering. Studier för att undersöka mutationsfrekvenser och priser genom fenotypiska val i haploid jäststammar under replika åldrande har ännu inte rapporterats.
Mutationshastigheter är vanligen mätt med användning fluktuations- tester 9. Mutationsfrekvensen värden återspeglar det totala antalet celler som härbärgerar en mutation i en gen-sekvensen i en population. Detta innefattar celler där oberoende mutationer uppstår och varje avkomma av dessa celler som helt enkelt ärver redan existerande mutationer. Däremot mutationshastigheter mäts genom fluktuation tester representerar antal oberoende mutationer som nyligen uppstår med varje cell generation. Dessa tester vanligtvis att ympa många replikatodlingar vid låga celldensiteter att minska sannolikheten för att lägga till celler med redan existerande mutationer i en målsekvens, växande kulturerna till nära mättnad och identifiering av muterade celler genom odling på selektivt medium. Antalet muterade celler som identifieras i likadana populationer används sedan i en av flera matematiska modeller för att uppskatta antalet independent mutationer som uppstått under tillväxt 9. Vid jämförelse av antalet oberoende mutationer att den genomsnittliga befolkningen storlek ger ett mått på den mutationshastighet. I S. cerevisiae, mutationsfrekvenser och priser ofta mäts med hjälp av URA3 och CAN1 gener, eftersom bortfall av funktionen mutationer i dessa gener producerar valbara fenotyper. Förlust av URA3-funktion gör celler resistenta mot 5-fluoroorotinsyra (5-FOA), eftersom det protein som kodas av URA3 omvandlar 5-FOA i en toxisk molekyl 10. Förlust av funktion av CAN1 tillåter celler att bli resistenta mot kanavanin, en toxisk arginin analog, eftersom det protein som kodas av CAN1 transporterar arginin och kanavanin i celler 11.
Både genetiska och fysiska sorteringsstrategier har framgångsrikt använts för att erhålla större populationer av S. cerevisiae moderceller för att underlätta utredningar av replika åldrande. Genetiska strategier inkluderar smarta metoder som väljer mot dottern cellöverlevnad i en population. Mamman program för anrikning (MEP) involverar beta-estradiol induktion av Cre rekombinas uttryck bara i dotterceller, vilket leder till dottern specifik störning av två viktiga gener som var konstruerade för att innehålla loxP platser 12. MEP-stammar kan odlas normalt i frånvaro av induceraren, men endast de moderceller kommer att fortsätta att dela sig efter induktion, medan dotterceller kommer att gripa vid M-fasen typiskt under deras första progression genom cellcykeln 12. Även om detta system inte har använts för att i stort sett studera mutations ackumulering under åldrandet, har den använts för att studera förlust av heterozygositet, en relativt frekvent form av genomet instabilitet i diploida jäststammar, samt biokemiska förändringar i åldrande mor celler 13,14. På samma sätt innebär dotter-arrester systemet dotter specifikt uttryck av S. cereviSIAE URA3-genen 15. Dotter-Skyddssystem stammar växa normalt tills 5-FOA sättes till mediet, vid vilken punkt dotterceller som uttrycker URA3 kommer att dö, medan moderceller fortsätter att växa 15. Dessa är användbara system för att berika för moderceller, men de är beroende av underhåll av genfunktioner som utgör urvalssystemet. Slumpmässiga mutationer i en eller flera komponenter i det selektionssystem kan resultera i dotterceller som undgår valet och föröka sig exponentiellt. Under utvecklingen av MEP stammarna, lämpliga befolknings storlekar var fast besluten att undvika uppkomsten av muterade dotterceller som kunde fly valet 12. Men denna gräns i befolkningens storlek äventyrar upptäckt av sällsynta former av genomet instabilitet under replika åldrande. Denna begränsning av befolkningens storlek kan delvis övervinnas genom användning av diploida jäststammar med två kopior av varje gen bidrar till urvalssystemet, eftersom de flestamutationer skulle sannolikt vara recessiv 12. Men användningen av diploida stammar begränsar de typer av mutationshändelser som lätt kan detekteras jämfört med dem som lätt kan detekteras i haploida jästceller.
Fysisk sorteringsstrategier omfattar isolering av moderceller med en märkt cellytan från omärkta dotterceller att berika för stora populationer av moderceller. Observationen att cellytproteiner (cellväggsproteiner) i S. cerevisiae dotterceller är nysyntetiserade under knopp har utnyttjats för att märka moderceller utan märkning av dotterceller som de producerar 16. Till exempel kan en första population av jästceller märkta på deras yta med biotin odlas och isoleras sedan från deras dotterceller med användning av anti-biotin mikropärlor och magnetisk sortering 16 eftersom dottercellerna som genereras av den initiala populationen inte kommer att innehålla biotin på sin yta . Seriell tillväxt ochsortering låter progressivt äldre populationer av moderceller som ska erhållas och analyseras. Detta förfarande har använts framgångsrikt för att undersöka förändringar i cellfysiologi och genuttryck under replika åldrande jäst 13,14,17,18. Den nuvarande metoden anpassar denna biotin märkning och magnetisk sortering teknik för att anrika moderceller i syfte att mäta ackumulationen av potentiellt sällsynta mutationer eller andra former av genomet instabilitet analyserade genom fenotypiska val. Serie tillväxt och fysisk sortering tillåter analys av mutations ackumulering i progressivt äldre moderceller, liksom i deras dotter cellpopulationer. Bestämning av mutationshastigheter per generation tillåter en förutsagd mutationsfrekvensen beräknas för moderceller som har genomgått en viss antal celldelningar. Sedan förutsagda frekvensvärden är baserade på den förväntade ökningen på grund av ytterligare omgångar av celldelning, betydande avvikelser i de observerade Mutatipå frekvenser jämfört med förväntade värden ger belägg för åldersspecifika förändringar i graden av ackumulerande mutationer. Med hjälp av detta protokoll, kan fluorescerande färgning av knopp ärr som motsvarar områden av celldelningar på moderceller i kombination med analys med flödescytometri användas för att snabbt bestämma åldersfördelningen av sorterade och osorterade populationer. Ytterligare fluorescerande reagens, såsom de som används för detektering av reaktiva syreföreningar, kan också utnyttjas under detta protokoll. Sammantaget gör detta protokoll effektiv analys av åldersberoende förändringar i genomet instabilitet med potential för korrelation till åldersrelaterade cell fysiologiska förändringar i modellorganism väl lämpade för att studera de genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar åldersrelaterade genomet instabilitet.
Detta protokoll kombinerar flera metoder för att aktivera resurser och metoder finns i Saccharomyces cerevisiae modellsystem som skall tillämpas på ett effektivt sätt till studiet av genomet instabilitet under mitotiska cellernas åldrande. Ett brett utbud av analyser för att kvantifiera olika former av genomet instabilitet genom fenotypisk selektion skulle kunna kombineras med magnetisk sortering undersöka tänkbara åldersspecifika förändringar i ansamling av särskilda former av mutationer eller kromosomrearrangemang. Även hel-genomet sekvense metoder skulle kunna ge mer information om de övergripande typer av förändringar som sker i ett genom med ålder, möjlighet att använda fenotypiska selektionssystem för att få mätningar mutationsfrekvens och att företrädesvis isolera specifika typer av genetiska förändringar är viktiga fördelar för att studera mekanistisk aspekter av åldrandet relaterade genomet instabilitet. Effektivisering bestämning av cell ålder och potential att göra parallella mätningar av physiological förändringar genom flöde ger cytometry effektivt sätt att korrelerar genomet instabilitet med andra cellulära förändringar under specifika åldersintervall. Fastställande av potentiella åldersberoende förändringar i andelen ackumulerande mutationer kräver: 1) noggrann bestämning av priser i unga cellpopulationer, 2) noggrann bestämning av cell ålder och 3) förmåga att på ett tillförlitligt sätt berika tillräckligt stora populationer av moderceller att reproducerbart mäta genomet instabilitet i ålderdomen. Detta tillvägagångssätt gör jästen modellsystem för att bidra till att definiera underliggande mekanismer som ansvarar för åldersberoende förändringar i priser och / eller frekvenser av genomet instabilitet i mitotiskt aktiva celler. Dessutom kan genetiska och miljömässiga faktorer snabbt bedömas för bidrag till åldersberoende genomet instabilitet. I slutändan kan dessa beskrivningar leda till utveckling av modeller som står för det sätt på vilket mutationer ackumuleras under replika åldrande.
Denna metod är beroende av förmågan att detektera mutationer eller andra typer av genomet instabilitet genom uppkomsten av valbara fenotyper för att mäta andelen sådana händelser. Däremot kan kreativitet i analys designen tillåter många aspekter av genomet instabilitet som skall undersökas. Exempelvis kan URA3- och CAN1 generna placeras på olika genomiska platser för att testa eventuella influenser av genomisk plats på resultat. Återgång av specifika icke-funktionella gen alleler för funktionell gen alleler kunde testa särskilda mutationsprocesser. Dessutom kan införandet av ett flertal inaktiva alleler av en gen eller flankerar en gen med upprepningssekvenser användas för att undersöka rekombinationshändelser genom restaurering eller förlust av genfunktion, respektive. Fluktuationer tester är standardförfarandet för att fastställa priser för dessa olika genomet instabilitet evenemang 9. Protokollet är skriven med hjälp av väl accepterade och relativt okomplicerad Lea-Coulson median estimatorn att bestämma mutatakt för att göra den mer tillgänglig för olika forskare, trots att MSS-maximum likelihood estimator metod anses vara den bästa metoden för att bestämma mutationshastigheter 9. MSS-maximum likelihood estimator har tidigare granskats i detalj 9, och kan användas som en alternativ metod, men kräver mer avancerade beräkningar. Alternativt har fri programvara för att beräkna mutationshastigheter med denna metod gjorts tillgängliga 22. Att få reproducerbara mått på mutationshastigheter kräver uppmärksamhet på några aspekter av experimentell design, bland annat med hjälp tillräckliga replikatodlingar, ympa kulturer vid låga nog initiala celldensiteter att befolkningsstorleken ökar med 10.000-faldig eller mer, och välja lämpliga kulturvolymer så att hela population av celler kan spridas på selektivt medium. För den senare punkten, kan en tidigare beskriven formel användas för att justera den mutationshastighet baserad på den fraktion av kultur tested 9. Variation i tillväxttakten av kulturer kan försvåra fastställandet av en reproducerbar mutationshastighet, och en modifierad median baserad estimator som kan ge mer reproducerbara resultat i sådana situationer har nyligen beskrivits 23.
Förmågan att noggrant mäta cell ålder är en annan faktor som är viktig för att fastställa om genomet instabilitet frekvenser i gamla celler skiljer sig från de värden som förväntas på grund av graden av händelserna i unga celler. Vi har hittat WGA färgning att föredra att kalkofluorvit färgning, både vad gäller bakgrund och flexibilitet, eftersom WGA finns konjugerad till olika fluorescerande molekyler. Denna flexibilitet kan ge fler möjligheter för samtidig mätning av andra cellegenskaper med fluorescerande reagenser. Inledande arbete för att upprätta en förbindelse mellan signalintensitet för WGA färgning och motsvarande antal knopp ärr på cellerna kan sedan leda till en mersnabb bestämning av cell ålder genom flödescytometri. Detta tillvägagångssätt möjliggör också användning av större befolkningsstorlekar än vad som normalt granskas av mikroskopi för bättre reproducerbarhet mätningar. Medan alla åldersbestämningar kan göras genom mikroskopisk undersökning av cellerna, anser vi att flödescytometri metod underlättar snabb screening av faktorer som påverkar åldersberoende genomet instabilitet.
Förutom att mäta cell ålder tillförlitligt, måste hänsyn tas till det antal celldelningar moderceller tillåts genomgå med varje successiv runda växa och sortera celler. Användning av en mindre initial population storlek eller större odlingsvolym kan tillåta celler att genomgå fler celldelningar innan den når önskad celltäthet. Exempelvis har andra forskare använt endast två rundor av sortering för att erhålla mycket gamla jästceller 16, som har den uppenbara fördelen av att erhålla gamla celler med färre experimental steg. När kommissionen överväger att öka odlingsvolym för att låta cellerna att slutföra fler celldelningar före sortering, tänk på gränsen för det totala antalet celler som kan behandlas i en enda kolumn. Användning av en större kulturvolym kan göra det nödvändigt att använda flera kolumner för att sortera en cellpopulation. Dessutom, om cellerna genomgår färre omgångar av celldelning mellan sorterar / insamlingspunkter, då det finns fler möjligheter att observera avvikelser från förväntade mutationsfrekvenser vid olika tidpunkter under livslängden. Till exempel kan provtagning endast vid tidiga och sena tidpunkter under livslängden fram uppgifter som tyder på en stadig ökning av mutationsfrekvensen, men provtagning vid ytterligare mellantider under livslängden kan visa att mutationsfrekvensen ökar snabbt och sedan planar ut. Eftersom detta protokoll isolerar gamla moderceller, finns det en möjlighet att få en mer direkt mått på förändringar i mutationshastigheter med åldern. Fluktuationer tester kunde be utfördes med användning av moderceller i olika åldrar för att bestämma huruvida mutationshastighet kommer att skilja sig från den hastighet som erhålls med användning av unga celler. Medan kulturer för dessa fluktuations- tester kommer att bli en blandning av gamla och unga celler när de växer, kan eventuella avvikelser från hastigheter erhållna startande med unga celler tillskrivas användningen av en äldre startpopulationen.
Förmågan att reproducerbart erhålla en tillräckligt stor population av åldrade moderceller för att noggrant mäta genomet instabilitet är kritisk för framgången med detta tillvägagångssätt. Medan protokollet beskriver användningen av en särskild magnetisk sorteringssystem för detta ändamål, har andra grupper sorterat jästmoderceller med alternativa system 14,18 (se tabell of Materials). Sådana alternativa system bör också arbeta med denna metod, även om vissa optimering av tillverkarnas protokoll skulle krävas. Oavsett det specifika system som används, befolkningsstorlek kräverd varierar beroende på hur ofta den typ av mutation eller genomet ombildning valts för studien. Vid minst måste det finnas tillräckligt med moderceller för att få åtminstone en mutant koloni per invånare för att beräkna en mutationsfrekvens. I praktiken kan resultaten vara ganska varierande om endast noll till fem muterade kolonier väntas från befolkningsstorlek, och till och med en liten ökning av befolkningsstorleken, så att 5-10 muterade kolonier väntas, i hög grad kan förbättra reproducerbarhet. När biotinmärkning en utgångspopulation, återvinningseffektiviteten för varje sort måste tas i beaktande för att identifiera en lämplig befolkningsstorleken nödvändigt att mäta mutationsfrekvensen i gamla moderceller. Med 90% återvinning av moderceller efter varje sort, skulle bara 59% av den ursprungliga populationen återvinnas efter fem omgångar av tillväxt och sortering. Det sjunker till ~ 33% återvinning av den ursprungliga befolkningen efter fem omgångar av tillväxt och sortering om bara 80% av märkta moderceller återed under varje sort. Att mäta och maximera återvinningen är avgörande när mätning av låga händelser frekvens, eftersom en 2-3 gångers minskning av befolkningsstorleken lätt kan leda till otillförlitliga antal muterade kolonier per invånare.
Det finns många alternativ för att utöka eller ändra detta protokoll för att få en bredare förståelse av genomet instabilitet under mitotiska cellernas åldrande. Enkla exempel är att analysera hur förändringar i genfunktioner, förändringar media, eller andra förändringar miljö skick förändrar ansamling av mutationer med åldern. Mutation priser för unga celler med förändrade genen funktion eller i lämpligt tillstånd skulle mätas och användas för att fastställa om mutationer ackumuleras annorlunda än förutspått av hastighetsvärden och annorlunda än i kontrollcellpopulationer. Cellpopulationer vid olika punkter under replika åldrande kan utsättas för specifika stressfaktorer, såsom reaktiva syreradikaler eller DNA-skadande medel. Ettövergående och mild exponering för oxidativ stress inte väsentligt förändrar förmågan att utföra cellsortering (figur 3), men hårdare påkänningar kan komplicera återhämtning av celler. Preliminära experiment skulle vara nödvändigt att kontrollera att moderceller kan fortfarande återvinnas effektivt efter specifika påfrestningar. Dessutom kan de cellulära egenskaperna av isolerade stamceller analyseras i detalj, inklusive nivåer av reaktiva syreradikaler, mitokondrie och vakuolär morfologi och andra fysiologiska egenskaper som är förknippade med åldrande 3. Dessutom kunde de moderceller vara en utgångspopulation för en ytterligare behandling eller manipulation. Eftersom mor och dotterceller är fysiskt åtskilda under förfarandet, dottercellerna är också fortfarande tillgängliga för analys. Till exempel förändringar i fysiologiska egenskaper dotterceller eller den asymmetriska arv av skadade makromolekyler mellan jäst mor och dotterceller <sup> 24 kan jämföras med tidpunkten för eventuella intressanta förändringar i mutationsfrekvenser / priser. Mutation frekvenser för dottern cellpopulationer kan också erhållas för att försöka modellera om det finns asymmetrisk arv av mutationer under replika åldrande. Sammanfattningsvis kombinerar anrikning av moderceller genom magnetisk cellsortering med fluktuations- tester möjliggör fördelarna med S. cerevisiae modellsystem som skall tillämpas på ett effektivt sätt för att undersöka mekanismer som ansvarar för ackumulering av genetiska förändringar under mitotiska cellernas åldrande.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av bidrag R00AG031911 från National Institute on Aging av National Institutes of Health till PHM Innehållet i denna artikel inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |