נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה
Summary
במחקר זה, פלטפורמה חדשנית לחקור חתימות מולקולריות intraneuronal של תגובה לטיפול בהפרעה דו-קוטבית (BD) פותחה ומאומת. אפיתל ריח מחולי BD הושג באמצעות ביופסיות האף. אז microdissection לייזר ללכוד היה בשילוב עם זמן אמת RT PCR לחקור את החתימה המולקולרית של תגובה ליתיום בBD.
Abstract
הפרעה דו-קוטבית (BD) היא הפרעת נוירו-פסיכיאטרית חמורה עם הפתופיזיולוגיה הבינה היטב ובדרך כלל מטופלים עם מייצב מצב הרוח, ליתיום קרבונט. מחקרים בבעלי חיים, כמו גם מחקרים גנטיים מצביעים על כך שאדם ליתיום משפיע מטרות מולקולריות המעורבים בצמיחה עצבית, הישרדות והתבגרות, ובעיקר מולקולות מעורבות באיתות Wnt. בהתחשב באתגר האתי לקבלת ביופסיות מוח לחקר שינויים מולקולריים דינמיים הקשורים ליתיום-תגובה במערכת העצבים המרכזית (CNS), ניתן לשקול את השימוש בתאי עצב המתקבלים מרקמות חוש הריח כדי להשיג אפיתל ריח goal.The זה מכיל תאי עצב קולטני ריח בשלבים שונים של פיתוח ותמיכה בתאים כמו גליה. זה מספק הזדמנות ייחודית ללמוד שינויים דינמיים במערכת העצבים המרכזית של חולים במחלות נוירו-פסיכיאטריות, תוך שימוש ברקמת הרחה ליטול ללא חשש מביופסיות האף. כדי להתגבר על החסרון שמציב substזיהום antial של רקמת הרחה ביופסיה עם תאים לא-עצביים, גישה חדשנית להשגת אוכלוסיות תאים עצביים מועשרות פותחה על ידי שילוב של ביופסיות האף עם microdissection לייזר ללכוד. במחקר זה, מערכת לחקירת שינויים מולקולריים דינמיים הקשורים לטיפול ברקמה עצבית פותחה וקבלה תוקף, באמצעות מדגם טייס קטן של חולי BD גויסו למחקר של המנגנונים המולקולריים של תגובה לטיפול ליתיום.
Introduction
הפרעה דו-קוטבית (BD) היא הפרעת נוירו-פסיכיאטרית חמורה, המתאפיינת בשינויים פתולוגיים במצב רוח, לנהוג וקוגניציה 1. ליתיום משמש לטיפול בBD הוכח לשנות את רמות ה- mRNA המדינה יציבה של מספר רב של גנים במחקרים בבעלי החיים 2, אבל זה עדיין לא ידוע אם כל מולקולות אלה קשורים בתגובה קלינית בבני האדם 2. הבנת המנגנון של תגובת ליתיום תדרוש חוקרת שינויים מולקולריים הנוצר על-ליתיום ברקמות עצביות. למרבה הצער, זה לא מעשי להשיג ביופסיות מוח של חולי BD מראש וטיפול בפוסט ליתיום לזהות חתימות מולקולריות של תגובה ליתיום. רקמות מוח פוסט-מורטם נעשו שימוש כדי ללמוד סמנים ביולוגיים בBD, עם זאת, הם לא יכולים לשמש כדי להעריך סמנים מולקולריים הקשורים לשינויים דינמיים ברגשות, קוגניציה ולנהוג; ואת תוקפו של תגובה לטיפול ליתיום הובררה למפרע יכול להיות בעייתי 4. לימפוציטים ותאי דם אחרים יכולים להיות שימושיים, אבל שינויים מולקולריים בתאי דם עלולים שלא לשקף שינויים עצביים 3-5. נוזל השדרתי עשוי להיות מספיק כדי לקבל מידע על מולקולות תאיות שעשויים לשקף שינויים מהותיים הקשורים למחלות והתרופות-הפיכה.
אפיתל הריח (OE) הוא חלק ייחודי של מערכת העצבים המרכזית (CNS), הקשורות למבני embryologically הלימבית 6; והוא נגיש בקלות באמצעות ביופסיות האף. זה מורכב של גליה-כמו תמיכה בתאי תאים (כלומר, sustentacular), בסיס מתרבים, ותאי עצב קולטני ריח בשלבים שונים של פיתוח 7-9. לכן, OE מספק הזדמנות ייחודית ללמוד accessibly שינויים דינמיים במערכת העצבים המרכזית של חולים במחלות נוירו-פסיכיאטריות 7. מחקרים מדגימים את התועלת של OE כרקמה פונדקאית לחקירת אירועי מחלה קשורה המשקפים OCC אלהurring בתאי עצב במוח 8,9. לדוגמא, מחקרים מנוצלים OE לחקור פרופילים מולקולריים הקשורים במצבים פסיכיאטריים 10-14. מערכת חוש הריח משמשת גם לזיהוי endophenoytpes הקליני כגון גירעונות ריח הקשורים לסימפטומים שליליים של סכיזופרניה 15. בנוסף, תהליכי התפתחות נוירולוגית להמשיך בOE לאורך כל חיים, מתן השדרה שימושית למודל הפתופיזיולוגיה הבסיסית של 8,9 מצבים פסיכיאטריים.
עם זאת, חסרון לשימוש ברקמה זו הוא הזיהום המשמעותי של ביופסיות חוש הריח עם תאים שאינם עצביים 16. לדוגמא, RNA הכולל המשמש למחקרי ביטוי גנים במחקרים קודמים OE הכיל RNA שחולץ מן רקמות האף כל ביופסיה כוללים RNA מהתאים שאינם עצביים 17. לכן, גישות קודמות היו מוגבלות על ידי האיכות של תאים. כדי להתגבר על בעיה זו, גישה חדשנית להשגה אוכלוסיות תאים עצביות מועשרות על ידי שילוב של ביופסיות האף עם microdissection לייזר ללכוד (LCM) פותחו 18.
LCM הוא טכניקה המאפשרת לבידוד סלקטיבי של תאים באמצעות חיתוך לייזר UV בשילוב עם לייזר אינפרא-אדום 19-21. LCM שילוב עם גישת OE ממזער זיהום משמעותי של OE על ידי תאים שאינם עצביים, ובכך משפר את ההעשרה של תאים עצביים 18. יתר על כן, השכבה העצבית ניתן להבחין בין שכבת submucosa תחת מיקרוסקופ, ובכך מבטלת את הצורך בצביעה. עוד ניתן להבחין בין אוכלוסיות תאים אחרות סוגים עצביים תא באמצעות נוגדנים ראשוניים אשר באו לידי ביטוי בסוג התא של עניין 7. לכן, הליך זה קובע שיטה קלה יותר להעשרת אוכלוסיית תאים כמעט אך ורק עצבית שיכול לשמש למחקרי ביטוי גנים, אימונוהיסטוכימיה וחקירות מורפולוגיים אחרות.
ve_content "> מחקר זה נועד להקמת פלטפורמה ניסיונית לחקור שינויים מולקולריים בתאי עצב הרחה הקשורים במצבי מחלה ותגובה לטיפול. כדי לטפל בזה, קבוצה קטנה של חולים ללא עישון שעמדה בקריטריונים לאבחון DSM-IV לBD המבוססת על ראיון האבחון למחקרים גנטיים (DIG) 22 גויס לעבור שתי ביופסיות האף: ביופסיה אחד מראש טיפול בליתיום והביופסיה השנייה, לאחר 6 שבועות של טיפול אוראלי יומי ליתיום יתר על כן, חולי BD זכאים חייבים להיות:. סימפטומטי לדיכאון , המבוסס על ניקוד ≥10 מתוך 60 במטפל מנוהל מונטגומרי-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; סימפטומטי להיפומאניה או מאניה, המבוסס על ציון ≥10 מתוך 56 על המטפל מנוהל יאנג-מאניה Rating Scale (YMRS) 24;. או ≥10 בשני MADRS וYMRS מקדם מדרג-Inter-מדרג של ההסכם בין רופאים לשני הסולמות הוא> 0.96 לאחר ביופסיות, נוירונים היו enri.CHED מOE ידי LCM. בעקבות אמצעי בקרת איכות נוספת, כדי להבטיח מיצוי של RNA באיכות גבוהה מהרקמה וההעשרה עצבית, Real Time PCR RT נערך לחקור רמות של לפני וביטוי שלאחר הטיפול של הגנים של עניין. הסעיפים שלאחר מכן מכילים תיאור של האימות של גישה זו, המדגישה את אופטימיזציה של הפרוטוקול והאסטרטגיות שיושמו לפרוטוקול ירי-צרות.Protocol
Representative Results
Discussion
פלטפורמה חדשה לקבלת שכבות עצביות חוש הריח מועשרות על ידי שילוב של הביופסיה וLCM האף מוצגת וקבלה תוקף במחקר זה. טכניקה זו יכולה להיות השלכות נרחבות. זה יכול להיות מיושם ללימודי סמן ביולוגי, כוללים אלה של תגובה לטיפול, ומאמצים לגילוי תרופות לתנאי נוירו-פסיכיאטריים אחרים…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
Referências
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. . Manic-depressive illness. , (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).
- Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
- Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
- Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
- Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
- Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
- Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
- Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
- Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
- Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
- Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
- Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
- Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
- Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
- Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
- Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Nurnberger, J. I., et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
- Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
- Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).
