I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali
Summary
In questo studio, una nuova piattaforma per indagare le firme molecolari intraneuronali di risposta al trattamento nel disturbo bipolare (BD) è stato sviluppato e validato. Epitelio olfattivo da pazienti BD è stato ottenuto attraverso biopsie nasali. Poi laser-capture microdissezione è stato combinato con Tempo reale RT PCR per indagare la firma molecolare della risposta litio in BD.
Abstract
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico con fisiopatologia poco compreso e in genere trattate con lo stabilizzatore dell'umore, carbonato di litio. Gli studi sugli animali e studi genetici umani indicano che il litio colpisce bersagli molecolari che sono coinvolti nella crescita neuronale, la sopravvivenza e la maturazione, e in particolare le molecole coinvolte nella segnalazione Wnt. Data la sfida etica di ottenere biopsie cerebrali per studiare variazioni dinamiche molecolari associati con litio-risposta nel sistema nervoso centrale (CNS), si può considerare l'uso di neuroni ottenuti da tessuti olfattive per raggiungere questo goal.The epitelio olfattivo contiene neuroni recettrici a diversi stadi di sviluppo e gliali come cellule di supporto. Questo offre un'opportunità unica per studiare i cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche, utilizzando il tessuto olfattivo ottenuto in modo sicuro da biopsie nasali. Per superare l'inconveniente posta dal substla contaminazione antial di tessuto olfattiva biopsia con cellule non neuronali, un nuovo approccio per ottenere popolazioni di cellule neuronali arricchito è stato sviluppato combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione. In questo studio, un sistema per studiare variazioni dinamiche molecolari associati al trattamento nel tessuto neuronale è stato sviluppato e convalidato, con un piccolo campione pilota di pazienti BD reclutati per lo studio dei meccanismi molecolari di risposta al trattamento litio.
Introduction
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico, caratterizzato da alterazioni patologiche di umore, guidare e cognizione 1. Litio usato per il trattamento di BD ha dimostrato di alterare costanti i livelli di mRNA stato di un gran numero di geni in studi su animali 2, ma rimane sconosciuta se uno qualsiasi di queste molecole è associato con risposta clinica nell'uomo 2. Comprendere il meccanismo di risposta litio richiederebbe indagare i cambiamenti molecolari litio-indotta nei tessuti neuronali. Purtroppo, non è pratico di ottenere biopsie cerebrali di pazienti BD prenatale e della post-litio per identificare le firme molecolari di risposta litio. Post-mortem tessuti cerebrali sono stati utilizzati per studiare biomarcatori in BD, tuttavia, non possono essere utilizzati per valutare marcatori molecolari associati con i cambiamenti dinamici in emozioni, cognizione e guidare; e la validità di retrospettivamente accertato risposta al trattamento di litio può essere problematico 4. I linfociti e le altre cellule del sangue possono essere utili, ma i cambiamenti molecolari nelle cellule del sangue non possono riflettere le alterazioni neuronali 3-5. Liquido cerebrospinale potrebbe essere insufficiente per ottenere informazioni su molecole intracellulari che possono riflettere associate alla malattia e farmaci reversibile modifiche intrinseche.
L'epitelio olfattivo (OE) è una parte unica del sistema nervoso centrale (SNC), embriologicamente legati alle strutture limbiche 6; ed è facilmente accessibile attraverso biopsie nasali. Si compone di gliali come cellule di supporto celle (cioè, sustentacular), basali proliferanti, e neuroni olfattivi a diversi stadi di sviluppo 7-9. Pertanto, OE offre un'opportunità unica per studiare accessibilmente cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche 7. Gli studi stanno dimostrando l'utilità del OE come un tessuto surrogato per studiare la malattia associata eventi che riflettono tali occurring in neuroni cerebrali 8,9. Ad esempio, gli studi hanno utilizzato OE per indagare i profili molecolari associati alle condizioni psichiatriche 10-14. Sistema olfattivo serve anche ad identificare endophenoytpes clinici come deficit odore che sono associati con i sintomi negativi della schizofrenia 15. Inoltre, i processi di sviluppo neurologico continuano nella OE per tutta la vita, fornendo un viale utile per modellare la fisiopatologia di condizioni psichiatriche 8,9.
Tuttavia, un inconveniente per l'uso di questo tessuto è la sostanziale contaminazione biopsie olfattivi con cellule non-neuronali 16. Per esempio, l'RNA totale utilizzato per studi di espressione genica in studi precedenti OE conteneva RNA estratto da nasale intera biopsia tissutale compreso RNA da cellule non-neuronali 17. Pertanto, gli approcci precedenti sono stati limitati dalla qualità delle cellule. Per ovviare a questo problema, un nuovo approccio per ottenere arricchito popolazioni di cellule neuronali combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione (LCM) è stato sviluppato 18.
LCM è una tecnica che consente l'isolamento selettivo di cellule usando taglio laser UV combinato con infrarossi laser 19-21. Combinando LCM con approccio OE minimizza sostanziale contaminazione OE da cellule non-neuronali, migliorando così l'arricchimento delle cellule neuronali 18. Inoltre, lo strato neuronale può essere distinto dallo strato sottomucosa al microscopio, eliminando così la necessità di colorazione. Tipi di cellule neuronali possono più essere distinti da altre popolazioni cellulari utilizzando anticorpi primari che sono espressi dal tipo di cellula di interesse 7. Pertanto, questa procedura prevede un metodo più semplice per l'arricchimento di popolazione cellulare quasi puramente neuronale che può essere utilizzato per studi di espressione genica, immunoistochimica e altre indagini morfologiche.
ve_content "> Questo studio mira a istituire una piattaforma sperimentale per studiare i cambiamenti molecolari nei neuroni olfattivi associati stati di malattia e la risposta al trattamento. Per risolvere questo problema, un piccolo gruppo di pazienti non-fumatori che hanno incontrato i criteri diagnostici del DSM-IV per BD basa su Intervista diagnostica per studi genetici (DIG) 22 è stato reclutato per subire due biopsie nasali: una biopsia pre-trattamento con litio e la seconda biopsia, dopo 6 settimane di terapia quotidiana litio orale Inoltre, i pazienti BD ammissibili devono essere:. sintomatico per la depressione , basata sul punteggio ≥10 su 60 nella clinico somministrato Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomatica per ipomania o mania, sulla base di un punteggio ≥10 su 56 sul medico somministrato Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. o ≥10 su entrambi MADRS e YMRS coefficiente Rater-Inter-Rater di un accordo tra i medici sia per le scale è> 0.96 Dopo biopsie, i neuroni erano Enri.ched da OE da LCM. A seguito di misure di controllo supplementari di qualità, al fine di garantire l'estrazione di RNA di alta qualità dal tessuto e arricchimento neuronale, Real Time RT PCR è stato condotto per indagare i livelli di pre e post-trattamento di espressione dei geni di interesse. Le sezioni successive contengono una descrizione della convalida di questo approccio, mettendo in evidenza l'ottimizzazione del protocollo e le strategie che sono state applicate per la risoluzione dei problemi del protocollo.Protocol
Representative Results
Discussion
Una nuova piattaforma per l'ottenimento arricchiti strati di neuroni olfattivi combinando biopsia nasale e LCM è presentato ed è stato convalidato in questo studio. Questa tecnica può avere implicazioni diffuse. Può essere applicato verso studi biomarcatori, compresi quelli per la risposta al trattamento, e gli sforzi di scoperta di farmaci per altre condizioni neuropsichiatriche, avere un impatto più ampio nel campo.
Per ottenere i neuroni di alta qualità suscettibili di applicazi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
Referências
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