Olfactory Nevroner innhentet gjennom Nasal Biopsi Kombinert med Laser-Capture mikrodisseksjon: En Potential tilnærming til Study Behandling Response i psykiske lidelser

Summary

I denne studien, til en roman plattform undersøke intranevronale molekylære signaturer av behandlingsrespons ved bipolar lidelse (BD) ble utviklet og validert. Lukteepitelet fra BD pasienter ble innhentet gjennom nese biopsier. Deretter laser-fangst mikrodisseksjon ble kombinert med Real Time RT PCR for å undersøke den molekylære signatur av litium respons i BD.

Abstract

Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig nevropsykiatrisk lidelse med dårlig forstått patofysiologi og vanligvis behandles med stemningen stabilisator, litiumkarbonat. Dyrestudier samt menneskelige genetiske studier indikerer at litium påvirker molekylære mål som er involvert i nevronale vekst, overlevelse og modning, og særlig molekyler involvert i Wnt signalering. Gitt den etiske utfordring å skaffe hjernebiopsi for undersøkelse av dynamiske molekylære forandringer assosiert med litium-respons i det sentrale nervesystemet (CNS), kan man tenke seg bruken av neuroner oppnådd fra olfactory vev for å nå dette målet olfaktoriske epitel inneholder lukt reseptor neuroner på ulike stadier av utvikling og glial-lignende støtte celler. Dette gir en unik mulighet til å studere dynamiske endringer i CNS av pasienter med nevropsykiatriske sykdommer, ved hjelp av lukte vev trygt oppnådd fra nese biopsier. For å overvinne den ulempen som utgjøres av substantial forurensning av vevsprøve olfaktorisk vev med ikke-nevronale celler, ble en ny tilnærming for å oppnå anrikede neuronal cellepopulasjoner utviklet ved å kombinere nese biopsier med laser-capture mikrodisseksjon. I denne studien ble et system for å undersøke behandlingsassosiert dynamiske molekylære forandringer i nervevevet utviklet og validert, ved hjelp av en liten pilot utvalg av BD pasienter rekruttert for studiet av molekylære mekanismer av litium behandlingsrespons.

Introduction

Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig nevropsykiatrisk lidelse, preget av patologiske endringer i humør, kjøre bil og kognisjon ^en. Litium brukes for behandling av BD har vist seg å endre steady state mRNA-nivåer av et stort antall gener i dyrestudier ^2, men det er fortsatt ukjent om noen av disse molekyler er assosiert med klinisk respons i mennesker ^2. Forstå mekanismen av litium svar ville kreve etterforsker litium-indusert molekylære forandringer i nervevevet. Dessverre er det ikke praktisk å få hjerne biopsier av BD pasienter før og etter litium terapi for å identifisere molekylære signaturer av litium respons. Post-mortem hjernevev er blitt brukt til å studere biomarkører i BD, men de kan ikke brukes til å vurdere molekylære markører knyttet til dynamiske endringer i følelser, kognisjon og drive; og gyldigheten av retrospektivt konstatert litium behandlingsrespons kan være problematisk ⁴. Lymfocytter og andre blodceller kan være nyttig, men molekylære endringer i blodceller viser ikke nødvendigvis den nevronale endringer ^3-5. Cerebrospinalvæsken kan være utilstrekkelig for å få informasjon om intracellulære molekyler som kan gjenspeile sykdomsassosierte og medisinering-reversibel iboende endringer.

Det olfaktoriske epitel (OE) er en unik del av sentralnervesystemet (CNS), embryologically-relatert til limbiske strukturer ^6; og det er lett tilgjengelig gjennom nese biopsier. Den består av glial-lignende bære (dvs. sustentacular) celler, basal prolifererende celler, og lukt reseptor nevroner på forskjellige utviklingsstadier ^7-9. Derfor gir OE en unik mulighet til å accessibly studere dynamiske endringer i CNS av pasienter med nevropsykiatriske sykdommer ^7. Studier demonstrerer nytten av OE som et surrogat vev for å undersøke sykdoms forbundet hendelser som gjenspeiler disse OCCurring i hjernens nerveceller ^8,9. For eksempel har studier benyttet OE å undersøke molekylære profiler forbundet med psykiatriske tilstander ^10-14. Luktsystemet tjener også til å identifisere kliniske endophenoytpes eksempel lukt underskudd som er forbundet med negative symptomer på schizofreni ^15. I tillegg nevrologiske prosesser fortsette i OE gjennom hele livet, og gir en nyttig vei å modellere den underliggende patofysiologien av psykiatriske tilstander ^8,9.

Imidlertid er en ulempe ved anvendelsen av dette vevet er vesentlig kontaminering av olfactory biopsier med ikke-nevronale celler ^16. For eksempel kan totalt RNA anvendes for genuttrykkstudier i tidligere studier OE inneholdt RNA ekstrahert fra hele nasal biopsied vev inkludert RNA fra ikke-nevronale celler ^17. Derfor har tidligere fremgangsmåter vært begrenset av kvaliteten av celler. For å overvinne dette problemet, til en ny tilnærming innhente beriket nevronale cellepopulasjoner ved å kombinere nasale biopsier med laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) har blitt utviklet ^18.

LCM er en teknikk som muliggjør selektiv isolering av celler ved hjelp av UV-laserskjæring kombinert med infrarød laser ^19-21. Kombinere LCM med OE tilnærming reduserer betydelig forurensning av OE av ikke-nevronale celler, og dermed styrke berikelse av nerveceller ^18. Videre kan den neuronale sjikt skilles fra submucosa lag under et mikroskop, og dermed eliminere behovet for farging. Nevronale celletyper kan videre skilles fra andre cellepopulasjoner ved hjelp av primære antistoffer som uttrykkes av cellen type interesse ^7. Derfor, etablerer denne fremgangsmåten en enklere fremgangsmåte for anriking av nesten rent neuronal cellepopulasjon som kan bli benyttet for genuttrykkstudier, immunhistokjemi og andre morfologiske undersøkelser.

ve_content "> Denne studien tar sikte på å etablere en eksperimentell plattform for å undersøke molekylære endringer i olfactory nevroner i forbindelse med sykdomstilstander og behandlingsrespons. For å løse dette, et lite sett med røykfrie pasienter som oppfylte DSM-IV diagnostiske kriterier for BD basert på Diagnostic Interview for genetiske studier (DIG) ²² ble rekruttert til å gjennomgå to nese biopsier: en biopsi pre-behandling med litium og andre biopsi, etter 6 uker med daglig oral litium terapi Videre må kvalifiserte BD pasientene være:. symptomatisk for depresjon , basert på scoring ≥10 av 60 i klinikeren administreres Montgomery-Åsbergs Rating Scale (MADRS) ^23; symptomatisk for hypomani eller mani, basert på en score ≥10 ut av 56 på klinikeren administreres Young-Mania Rating Scale (YMRS) ^24., eller ≥10 på begge MADRS og YMRS Rater-Inter-Rater koeffisient av enighet mellom klinikere for begge skalaer er> 0,96 Etter biopsier, nevroner var Enri.Ched fra OE av LCM. Etter ytterligere kvalitetskontroll tiltak, for å sikre utvinning av høy kvalitet RNA fra vevet og nevronale berikelse, ble Real Time RT PCR gjennomført for å undersøke før og etter behandling uttrykk nivåer av gener av interesse. De påfølgende avsnittene inneholder en beskrivelse av validering av denne tilnærmingen, fremhever optimalisering av protokollen og de strategier som ble brukt for feilsøking protokollen.

Protocol

MERK: All forskning frivillige i denne studien ble gitt informert samtykke dokumenter godkjent av Institutional Review Board of Howard University og Johns Hopkins University. Kun deltakere som samtykket ved å signere informert samtykke dokumenter ble innmeldt i studien. Studien base for denne analysen besto av: 20 personer (12 BD og 10 kontroller, 30% menn) og gjennomsnittsalder (sd) av 38.2 (14.1) år. MERK: Spray alle overflater med RNase Zap å fjerne RNase forurensning fra glass og plastflater. <p class=…

Representative Results

Protokollen og feilsøking strategi i studiet av molekylære signaturer ble vellykket optimalisert. RNA kvalitet og neuronal berikelse kriterier for prøver som skal brukes i videre nedstrøms Real Time-PCR-analyse ble standardisert. RIN og RNA konsentrasjonen ble undersøkt som konfunderende faktorer til oppdagede uttrykk nivåer. Basert på analyse av flere prøver med rins strekker 1-10, ble det fastslått at et minimum RIN på ~ 3,0 og ovenfor er tilstrekkelig for genetisk analyse i denne studien. Som et resultat, b…

Discussion

En ny plattform for å skaffe beriket olfactory nevronale lag ved å kombinere nasal biopsi og LCM er presentert og har blitt validert i denne studien. Denne teknikken kan ha vidtrekkende konsekvenser. Det kan brukes mot biomarkør studier, inkludert de for behandlingsrespons, og legemiddelforskning innsats for andre nevropsykiatriske tilstander, gjør en bredere effekt på feltet.

For å oppnå høy kvalitet nevroner mottagelig for nedstrøms applikasjoner, må bemerkes noen kritiske og fei…

Materials

Reagent	Manufacturuer	Manufacturer Catalog #
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds	Sakura Finetek	4557
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D)	Carl Zeiss Microscopy	415190-9041-000
Rnase Zap	Ambion	AM9780
DEPC Treated Water	Quality Biological	351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System	Carl Zeiss Microscopy
Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No.5 Dumont Microdissction Forceps	Roboz	RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit	Ambion	AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix	Invitrogen	11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes	Applied Biosystems	Various
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016