The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Den mogna ventilen är sammansatt av tre stratifierade skikt av specialiserad extracellulär matrix (ECM) varvat med ventil interstitiella celler (VICS) och inkapslad av ett enda skikt av hjärtklaffs endotelceller (VEC) 1. Roll ECM är att ge alla nödvändiga biomekaniska egenskaper för att klara ständiga förändringar i hemodynamiska kraft under hjärtcykeln. Omsättningen av ventil ECM i den vuxna ventilen är hårt reglerad av Vics som till stor del vilande och fibroblastliknande i frånvaro av sjukdom. Förutom den VIC befolkning, hjärtklaffs endotelceller (VEC) bildar en oavbruten endotel över ytan av ventil kuspar 2. Även betydelsen av ECM och Vics för ventil struktur och funktion har beskrivits av oss och andra, är den roll som VEC mindre känt. Dock är kritiskt för ventilbildning i embryot detta jämförelsevis liten cellpopulation och beskrivs som dysfunktionell i ventilensjukdom.
Hjärta ventilbildning i embryot börjar när en delmängd av endotelceller inom atrioventrikulär kanalen och utflöde regionerna genomgår endotelceller till mesenkymala transformation (EMT) och bilda svullnader som kallas endokardiska kuddar 1,3. De nyligen trans mesenkymala celler inom dessa strukturer senare differentiera till Vics och bildar de mogna ventilerna. När EMT är fullständig, endotelceller som omger kuddarna, benämnd VEC, bildar en oavbruten endotelcellskikt som skyddar det mogna ventilen mot skada. Dessutom VEC avkänna hemodynamiska omgivningen och har visats molekylärt kommunicera med underliggande VICS att reglera ECM homeostas 1,3. I sjuka ventiler är VEC monoskiktet störs i samband med onormala förändringar i ECM organisation och ändrade biomekanik 4,5. Dessutom studier i musmodeller antyder att VEC dysfunktion är den bakomliggande orsaken till ventil disease 1,6-9. Som VEC spelar en viktig roll i ventil utveckling, underhåll och sjukdom, är det viktigt att vi till fullo definiera sina timliga fenotyper för att föra fältet och förstå mekanismerna bakom sjukdomen.
Tidigare arbete av flera labs har framgångsrikt isolerade VEC från svin och får modellerna 10-12. På grund av den stora storleken på dessa ventiler, isoleringar genom bomullstopp och / eller enzymatisk nedbrytning, följt av ett antal olika isoleringsmetoder inklusive magnetisk pärla cellseparation och enda cell klonal expansion har varit effektiv för att generera rena populationer 11-13. Dock kan dessa modeller vara restriktiv på grund av den ofullständiga anteckningen av gris och får genomen som begränsar tillgängligheten av molekylära verktyg utöver de höga kostnaderna. Därför experiment av svin och får VEC efter isolering kan vara begränsande. Musmodeller är att föredra på grund av de många möjligheterna till genetisk manipulation och molekylära verktyg i embryot och vuxna, men hittills inga VEC isoleringar i små djurmodeller har rapporterats. Detta beror sannolikt på att det är svårt att arbeta med små vävnadsprover som inkluderar en minoritet cellpopulation som för närvarande saknar unika identitet VEC-specifika markörer och därmed förhindra antikroppsbaserade isoleringsmetoder.
I denna artikel redovisar vi en ny metod för direkt isolering av murina VEC på embryonala och vuxna stadier. Detta protokoll tar fördel av Tie2-GFP-möss, som uttrycker GFP i alla endoteliala celltyper och har i stor utsträckning använts för att studera endotelial cellpopulationer 14. Emellertid är det nya i denna aktuella studien att dessa möss, som för första gången har använts för att isolera endotelceller från ventilerna. Genom noggrann dissektion av vävnad ventil och en serie av nio enzymatiska spjälkningar följt av FACS-sortering kan VEC isoleras och användas för olika experimentella tekniker isive RNA-extraktion och kultur, direkt efter sortering.
Här beskriver vi för första gången, ett nytt förfarande för isolering av embryonala och vuxna murina VEC från Tie2-GFP-möss. Även denna mus linje har i stor utsträckning använts för isolering av endotelceller cellpopulationer, detta är den första rapporten som visar selektiv isolering av VEC. På grund av bräcklighet VEC befolkning, har vi utvecklat en stringent protokoll som möjliggör enskild cell isolering av GFP positiva (och GFP negativ) celler från hjärtklaffar av embryonala och vuxna möss. Jämfört med den ursprungliga publikationen med hjälp av hela embryon eller organ från Tie2-GFP möss 14 har vi optimerat kollagenas och dissektion steg baserat på den låga förekomsten av denna sköra endotelceller befolkningen att isolera en utvald population av celler.
VEC isoleringar har tidigare endast rapporterats i stora djurmodeller med begränsade genetiska och biomolekylära verktyg. Dessa verktyg är väl etablerade i möss, och därför abihet att isolera murina VEC möjliggör en utökad uppsättning experimentell design som ska användas för hjärtklaff forskning. Därför är en betydande fördel med detta tillvägagångssätt att VEC kan isoleras tidsmässigt från vildtyp möss och modeller av ventil sjukdomar och skador. En andra fördel är att VEC kan isoleras och analyseras nästan omedelbart efter dissektion, bevara uttrycksmönster som återspeglar situationen in vivo mer exakt. Vidare är denna isolering protokoll tillräcklig för att eliminera cellkultur för antal expansion och därför potentiella fenotypiska förändringar inducerade av den in vitro-miljön förhindras.
Trots nyheterna och experimentella fördelarna med detta protokoll, inser vi att begränsningar fortfarande föreligger. Först storleken VEC populationen inom murina ventiler är mycket liten och därför sänds flera tajmade embryonala kullar som krävs för att generera tillräckligt med RNA för genuttrycksanalys. Medan this kan övervinnas med hjälp av flera uppfödare, kan det påverka tillämpningen av några efter isolering analysverktyg. Denna begränsning har varit en utmaning särskilt för upprättande sammanflytande kulturer av GFP-positiva VEC för att utföra fler grundliga analyser av VEC fenotyper inklusive molekylära profiler och funktionella analyser. Därför erkänner vi att inte alla svårigheter har övervunnits av vår strategi, men detta är ett område av intresse som vi strävar efter att övervinna.
Detta tillvägagångssätt att isolera VEC från klaff regioner införs möjligheten för kontamination från Tie-GFP-positiva, icke-klaff endotelceller endokardiet eller kärlstrukturer inom kammarhjärtmuskulaturen. Hittills har inte identifierat molekylära skillnaden av VEC från andra hjärt endothelial cellpopulationer. Emellertid en enhancer region av Nfatc1 gen har identifierats och visat att specifikt märka VEC som inte gör detgenomgår EMT, och ingen annan endotelceller populationen i hjärtat 18. Som Cre modell (Nfatc1 ENCRE) finns tillgänglig, kan framtida studier utnyttja specificiteten hos denna linje för att minimera kontamineringsrisker. Förutom icke-klaff Tie2-GFP- positiva celler, det finns alltid risken för föroreningar från myocyter vid den punkt där ventilbladen fäster den ringformade området av septal och vägghjärtväggar. I uppgifter som inte visas här, från början började vi studier för att isolera VEC från dissekerade klaff regioner som använder antikropps konjugerade kulor belagda med anti-GFP och anti-CD31. Medan detta tillvägagångssätt var framgångsrikt för isolering av de endotelceller, vi upplevt signifikant cellklumpning från intilliggande, icke-endotel-celltyper och därför VICS och myokardceller förorenat vår experimentella provet. Detta har undvikits genom att använda FACS-analys som parametrar har ställts in för att isolera bara encellssuspensions och PCR-analys för att detektera uttryck av myocyt specifika gener har kontrollerat för denna begränsning (Figur 3). Medan vår förorening kan anses som minimal, är det fortfarande en potentiell experimentell komplexitet som skulle kunna undvikas i framtiden med den dubbla val av GFP och endotel cellspecifika ytmarkörer.
Med hjälp av detta protokoll, har vi framgångsrikt isolerade VEC från embryonala och vuxna möss och som exempel på hur denna metod kan användas för RNA-isolering och cellodling av GFP-positiva och GFP negativ cellpopulationer. Emellertid är detta tillvägagångssätt inte begränsat till dessa tillämpningar och kan användas för en mängd olika molekylära, cellulära och funktionella metoder. Dessutom kan den Tie2-GFP bakgrund paras med genetiska musmodeller som kommer att möjliggöra jämförande studier av VEC populationer i hälsa och sjukdom. Utvecklingen av denna nya metod kommer, för första gången, möjliggöra fokuserade studierundersöka bidrag VEC i ventil utveckling och underhåll och kunde avslöja tidigare skattade mekanismer endotelberoende ventil sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytisk Cytometry Core-anläggning, särskilt Katrina Moore, för tekniskt stöd med FACS-analys. Dessutom inser vi Dr William Pu och hans grupp för deras vetenskapliga insikter. Detta arbete stöddes av NIH HL091878 (JL) och The Heart Center vid Nationwide barnsjukhuset.
[header] | |||
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
Trizol | Ambion | 15596018 | |
α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |