Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Med takten i vetenskapens framsteg accelererar snabbt, behövs nya metoder för experimentell neurovetenskap för att snabbt och enkelt manipulera genuttrycket i mushjärna. Här beskriver vi en teknik som först introducerades av Passini och Wolfe för direkt intrakraniell leverans av viralt kodade transgener i neonatal mushjärna. I sin mest grundläggande form, kräver förfarandet endast en ice och en mikroliter spruta. Däremot kan protokollet också anpassas för användning med stereotaktiska ramar för att förbättra överensstämmelsen för forskare nya till tekniken. Metoden bygger på förmågan hos adenoassocierat virus (AAV) att röra sig fritt från de cerebrala ventriklarna i hjärnparenkymet medan ependymceller fodret är fortfarande omogen under första 12-24 timmar efter födseln. Intraventrikulär injektion av AAV i denna ålder ger utbredd transduktion av nervceller i hela hjärnan. Expression börjar inom några dagar efter injektionen och kvarstår för lifetime av djuret. Viral titer kan justeras för att styra densiteten hos transducerade neuroner, medan samuttryck av ett fluorescerande protein ger en viktig etikett av transducerade celler. Med den ökande tillgängligheten av virala core faciliteter för att ge både off-the-shelf, färdigförpackade reagenser och anpassade viral förberedelser, ger denna lösning en tid metod för att manipulera genuttrycket i musen hjärnan som är snabbt, enkelt och mycket billigare än traditionell könsceller engineering.
Traditionella metoder för att modifiera neurala genuttryck kräver tidskrävande och dyra nedärvda manipulationer. Alternativa de novo lösningar såsom i livmodern elektroporering eller stereotaxisk lentiviral injektion ger snabbare resultat och är billigare, men har nackdelen att de kräver komplicerade kirurgiska ingrepp 1-3. Dessutom har transgenexpression en begränsad geografisk räckvidd med dessa metoder. Häri beskriver vi en snabb, enkel och ekonomisk metod för omfattande neuronal manipulation via intraventrikulär injektion av adenoassocierat virus (AAV) i neonatal mushjärna. Förfarandet beskrevs först av John Wolfe och Marco Passini i 2001, där de föreslog liten partikelstorlek av AAV tillät den att diffundera inom den cerebrala spinalvätskan då den passerar från de laterala ventriklarna via omogna ependymala barriären och in i hjärnparenkymet 4, 5. Intraventrikulär injektion av AAV inom first 24 h efter födseln utbyten utbredd viral transduktion av neurala delmängder som spänner varje region av hjärnan, från lukt glödlampor till hjärnstammen 6,7. Viralt levererade transgener uttrycks och aktiv inom några dagar efter injektionen och kvarstår i upp till ett år efter transduktion. Således denna mångsidiga manipulation möjliggör studier som sträcker sig från tidig postnatal hjärnutveckling till åldrande och degeneration i den vuxna.
Vid anpassning av tekniken till våra specifika experimentella behov har vi främst fokuserat på AAV8 serotyp eftersom det är den mest effektiva på att omvandla nervceller 6. Vi visar att virus titer kan spädas för att kontrollera tätheten av omvandlade nervceller för experiment som testar cell inneboende konsekvenserna av genmanipulation. Dessutom visar vi att två virus kan vara co-injiceras för att producera uttrycksmönster som är inställda distinkta eller överlappande uppsättningar av nervceller, beroende på de serotyper som valts förviral förpackningar. Vårt arbete expanderar den mångsidigheten hos denna teknik för användning i ett brett område av experimentella neuroscience inställningar.
Vi har beskrivit ett mångsidigt förfarande för att manipulera neuronal genuttryck genom att använda AAV som ett medel för utbredd leverans i neonatal mushjärna. Jämfört med andra metoder för neuronal transgenes såsom i livmodern elektroporering pt eller stereotaxisk intrakraniell injektion 2,3, är neonatal viral injektion relativt lätt och enkel. Den grundläggande proceduren kan utföras på några minuter med bara en ice och en mikroliter spruta. Optimal överlevnad och transgenexpres…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |