A telomerase é expressa no cérebro neonatal e também em regiões distintas do cérebro adulto. Apresentamos um ensaio TRAP não tóxico que economiza tempo para a análise da atividade da telomerase em várias regiões do cérebro de camundongos e detecção de diferenças na atividade da telomerase entre cérebros de camundongos machos e fêmeas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay
Neste artigo
Resumo
Resumo
A telomerase, uma ribonucleoprotein, é responsável por manter o comprimento dos telômeros e, portanto, promover a integridade genômica, proliferação e longevidade. Além disso, a telomerase protege a mitocôndria do estresse oxidativo e confere resistência à apoptose, sugerindo sua possível importância para a sobrevivência dos não-mitótico, células altamente ativos, tais como os neurônios. Nós já demonstraram a capacidade dos novos ativadores de telomerase para aumentar a atividade da telomerase e expressão nas diferentes regiões do cérebro do rato e para proteger as células neurônios motores do stress oxidativo. Estes resultados vêm reforçar a noção de que a telomerase está envolvida na protecção dos neurónios de várias lesões. Para sublinhar o papel da telomerase no cérebro, nós aqui comparar a atividade da telomerase em masculino e feminino cérebro do rato e sua dependência da idade. Ensaio TRAP é um método padrão para a detecção de actividade da telomerase em várias linhas celulares ou tecidos. Aqui demonstramos a Analysis da actividade da telomerase em três regiões do cérebro do rato por não-desnaturante CHAPS extracção de proteína utilizando um tampão de lise seguido por uma modificação do ensaio TRAP padrão.
Neste ensaio, em 2 passos, a telomerase endógeno alonga um substrato da telomerase específico (TS iniciador) adicionando TTAGGG 6 repetições bp (reacção da telomerase). Os produtos de reacção da telomerase são amplificados por meio de reacção de PCR a criação de uma escada de DNA de incrementos de 6 bp. A análise do segmento de ADN é feita por electroforese em gel de agarose de alta resolução de 4,5%, seguido por coloração com mancha de ácido nucleico altamente sensível.
Em comparação com o ensaio TRAP tradicionais que utilizam 32 marcado com P radioactivo de dCTP do para a detecção do ADN e de electroforese em gel de poliacrilamida para resolver a escada de DNA, este protocolo oferece um tempo de não-tóxico poupança ensaio TRAP para a avaliação da actividade de telomerase no cérebro do rato, o que demonstra a capacidade de detectar diferenças na telomerasatividade e nos diversos região do mouse cérebro feminino e masculino.
Introdução
A telomerase é uma ribonucleoproteína composto por transcriptase inversa da telomerase (TERT), a subunidade catalítica de telomerase e um componente de RNA (TERC). O papel canônica da telomerase é preservar o comprimento adequado dos telômeros pela adição de sequências repetitivas (TTAGGG) para as extremidades teloméricas, portanto, promover a integridade genômica e proliferação celular 1. Papéis adicionais foram atribuídos a TERT em células, ou seja, que confere resistência à apoptose induzida por vários agentes prejudiciais 2, protege as células estaminais mesenquimais humanas a partir de estresse oxidativo 3, e desempenha ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
As experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação animal no Universidade Ben-Gurion (IL-39-08-2010).
1. rato Cérebro extração de proteínas
- Preparar 3 tubos de 15 ml cada, contendo 5 ml de solução e colocar tubos de Ringer no gelo.
- Sacrifique o mouse usando anestesia isoflurano (ATENÇÃO - usar capuz química) por 10-20 segundos, seguido por deslocamento cervical e decapitação imediata.
- Remover o cérebro do crânio e enxaguar durante alguns segundos com uma solução gelada de Ringer para evitar danos no tecido cerebral.
- Usando uma lâmina cirúrgica, separar o cerebelo (CR....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Extratos de proteínas de células inteiras foram preparados a partir do lobo frontal (FL), tronco cerebral (BS) e cerebelo (CR), obtido a partir de 3 CD-1 do sexo feminino e 3 CD-1 camundongos machos com as idades de 1 e 3 meses de idade para a ensaio TRAP modificado e 3 ratinhos CD-1 do sexo masculino com a idade de 2 meses de idade para o ensaio TRAP radioactivos. A actividade da telomerase foi detectada em 1 mg de extracto de proteínas usando o ensaio TRAP modificado e extrair 2 ug de proteínas para o ensaio TRAP radi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Análise de actividade da telomerase no cérebro do rato através do ensaio TRAP é constituído por quatro etapas principais: 1) extracção de proteínas a partir de regiões específicas do tecido cerebral 2) TS alongamento do iniciador pela telomerase - reacção da telomerase 3) amplificação dos produtos de reacção da telomerase por RCP 4 ) separação dos produtos de PCR em gel de agarose, utilizando alta resolução.
Este ensaio TRAP modificado aborda duas grandes dificuldades que se erguem a partir .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela tecnologia B.G. Negev e pela contribuição de Linda Powers.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Feito manualmente, misture o seguinte em UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (adquirido da Sigma). As alíquotas são congeladas a -20 ° C. | ||
| de Ringer | Feita manualmente, misture o seguinte em DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4· H2O, 2 mM de MgSO4, 26 mM de NaHCO3, 1,802 g/L de D-(+)-glicose anidra. | ||
| Isoflurano | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Manuseie com cuidado em um capuz químico |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Oligos de DNA Sigma | encomendados em formato DRY e UPW adicionados de acordo com a concentração necessária | |
| Primer ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Oligos de DNA Sigma | encomendados em formato DRY e UPW adicionados de acordo com o requisito concentração | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| Agarose de alta resolução | Sigma | A4718 | Qualquer agarose de alta resolução de alta qualidade pode ser sutible |
| Aparelho de Mini-gel | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Mancha de ácido nucleico (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCTCGGCCTTTT-3') | Oligos de DNA Sigma | solicitados no formato DRY e UPW adicionados de acordo com a concentração necessária | |
| Tampão de lise CHAPS | Tecnologia de sinalização celular | 9852S | Adicione PMSF (inibidor de protease) a uma concentração final de 1 mM |
| de água ultrapura (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| Camundongos CD-1 | HARLAN Laboratories INC. |
Referências
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by nove....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
