L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction<em> In Vitro</em

Summary

Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro.

Abstract

Le développement de tests in vitro prédictifs et biologiquement pertinents repose sur la promotion des systèmes de culture cellulaire polyvalents qui facilitent l'évaluation fonctionnelle des cellules ensemencées. A cet effet, la technologie de micro-cantilever offre une plate-forme permettant de mesurer les fonctions de contraction d'une gamme de types de cellules, y compris squelettique, cardiaque, et les cellules musculaires lisses, grâce à l'évaluation de la contraction induite par le substrat de pliage. Application des réseaux multiplexés en porte à faux fournit les moyens pour développer des protocoles modérée à forte capacité d'évaluation de l'efficacité des médicaments et de la toxicité, le phénotype de la maladie et de progression, ainsi que les interactions neuromusculaires et autre cellule-cellule. Ce manuscrit fournit les détails de fabrication de tableaux en porte à faux fiables à cet effet, et les méthodes requises pour mener des cellules de culture sur ces surfaces. Une description plus détaillée est fournie sur les mesures nécessaires pour effectuer anal fonctionnelleyse de types de cellules contractiles maintenu sur de tels réseaux à l'aide d'un laser selon l'invention et d'un système photo-détecteur. Les données représentatives présente les points saillants de la précision et de la nature reproductible de l'analyse de la fonction contractile possible d'utiliser ce système, ainsi que le large éventail d'études à laquelle cette technologie peut être appliquée. L'adoption généralisée de succès de ce système pourrait fournir aux enquêteurs les moyens d'effectuer des études fonctionnelles, à faible coût rapides in vitro, conduisant à des prévisions plus précises de la performance des tissus, le développement de la maladie et la réponse au traitement thérapeutique.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

Protocol

1.-faux fabrication de puces Détails illustrés des étapes de fabrication décrites sont fournies sur la figure 1. Placez plaques de silicium sur isolant (SOI) dans un four et cuire au four à 125 ° C pendant 20 min pour les déshydrater. Déposer une couche épaisse d'oxyde de silicium de 1,5 pm sur la couche de poignée de la plaquette SOI déshydraté au moyen d'un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) outil. Placer la…

Representative Results

Culture réussie des cellules contractiles sur des consoles est une procédure relativement simple, en utilisant des techniques classiques de culture cellulaire (figure 5). Le pourcentage de consoles supportant les cellules contractants varie en fonction du type de cellule en cours d'examen et la technique de culture spécifique utilisé. En utilisant des cellules embryonnaires primaires dérivées de membres postérieurs chez le rat, l'activité contractile a été détecté sur 12% des cantile…

Discussion

Les étapes essentielles de l'analyse microscopique des consoles de preuve de contraction cellulaire sont le placement de la puce de porte à faux à l'intérieur de la platine du microscope, et l'alignement ultérieur du laser et photo-détecteur à l'extrémité des leviers de coin dans la matrice. Si ce n'est pas fait correctement, le logiciel ne pourra pas extrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau, qui pourrait conduire à l'accumulation de faux négatifs lors de la coll…

Materials

Name of material/ equipment	Company	Catalog number	Comments/ Description
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	N/A
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ ml
Vascular Endothelial Growth Factor	Life Technologies	P2654	20 ng/ ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500	N/A
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport	N/A
Photo-detector	Noah Industries	N/A
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems	N/A
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments	N/A
Patch clamp microscope and stage	Olympus	N/A
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs	N/A
Axoscope software	Molecular Devices	N/A
LabVIEW software	National Instruments	N/A
37oC, 5% CO2 incubator	NAPCO	N/A
Class 2 microbiological flow hood	Labconco	N/A
Pipettes and tips	Eppendorf	N/A