ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות<em> במבחנה</em

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בזיזי סיליקון microscale כמשטחי תרבות גמישים למדידת ההתכווצות של תאי שריר במבחנה. התכווצות סלולרית גורמת לכיפוף שלוחה, הניתן למדידה, נרשם, והוסב לקריאות כוח, מתן מערכת לא פולשנית וניתן להרחבה למדידת תפקוד התכווצות במבחנה.

Abstract

הפיתוח של מבחני חוץ גופייה יותר חזוי ורלוונטיים מבחינה ביולוגית מתבסס על קידום מערכות תרבית תאים צדדי המאפשרות הערכה התפקודית של תאי זרע. לשם כך, טכנולוגית שלוחה microscale מציעה פלטפורמה שבה למדוד את הפונקציונליות ההתכווצות של מגוון רחב של סוגי תאים, כוללים שלד, לב, ותאי שריר חלק, דרך הערכת מצע התכווצות מושרה כיפוף. יישום של מערכי שלוחה ריבוב מספק את האמצעים לפיתוח מתון לפרוטוקולי תפוקה גבוהה להערכת יעילות תרופה ורעילות, פנוטיפ מחלה והתקדמות, כמו גם יחסי גומלין תוקפת ותאי תאים אחרים. כתב יד זה מספק פרטים עבור בודה מערכי שלוחה אמינות למטרה זו, ושיטות הנדרשות להצלחת תאי תרבות על משטחים אלה. תיאור נוסף מסופק על הצעדים דרושים כדי לבצע אנאלי פונקציונלייסיס של סוגי תאי התכווצות שמר על מערכים כאלה באמצעות מערכת פוטו וגלאי לייזר ורומן. נתוני הנציג סיפקו רגעי שיא הדיוק והטבע לשחזור של הניתוח של פונקצית התכווצות אפשרית באמצעות מערכת זו, כמו גם מגוון הרחב של מחקרים שלטכנולוגיה כזו יכולה להיות מיושמת. אימוץ נרחב מוצלח של מערכת זו יכול לספק לחוקרים את האמצעים לבצע מחקרים תפקודיים מהירים, עלות נמוכה במבחנה, שמוביל לתחזיות מדויקות יותר של ביצועי רקמות, התפתחות מחלה ותגובה לטיפול טיפולי חדשני.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

Protocol

ייצור .1 צ'יפ קונסוליים פרטים בתמונות של שלבי הייצור המתוארים ניתנים באיור 1. הנח הסיליקון על מבודד (SOI) הוופלים בתנור ואופה ב125 ° C עבור 20 דקות לייבש אותם. <li style=";text-align:ri…

Representative Results

תרבות המוצלחת של תאי התכווצות בזיזים היא הליך פשוט יחסית, תוך שימוש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים (איור 5). אחוז זיזי תמיכה תאי הידבקות ישתנה בהתאם לסוג תא שנבחן וטכניקת תרבות מסוימת המועסקת. שימוש בתאים עובריים ראשוניים נבעו מגפיים אחוריות עכברוש, פעילות הה…

Discussion

השלבים הקריטיים בניתוח זיזים מיקרוסקופים לראיות של התכווצות סלולרית הם המיקום של שבב שלוחה בתוך הבמה מיקרוסקופ, והיישור הבא של הלייזר וצילום גלאי עם הקצה של זיזי הפינה במערך. אם זה לא נעשה באופן מדויק, ולאחר מכן את התוכנה לא תוכל להסיק את עמדותיהם של הזיזים שנותרו במ?…

Materials

Name of material/ equipment	Company	Catalog number	Comments/ Description
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	N/A
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ ml
Vascular Endothelial Growth Factor	Life Technologies	P2654	20 ng/ ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500	N/A
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport	N/A
Photo-detector	Noah Industries	N/A
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems	N/A
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments	N/A
Patch clamp microscope and stage	Olympus	N/A
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs	N/A
Axoscope software	Molecular Devices	N/A
LabVIEW software	National Instruments	N/A
37oC, 5% CO2 incubator	NAPCO	N/A
Class 2 microbiological flow hood	Labconco	N/A
Pipettes and tips	Eppendorf	N/A