Denne protokollen beskriver bruken av mikrosilisiumbommene som bøyelige kulturoverflater for å måle sammentreknings muskelceller in vitro. Cellular sammentrekning forårsaker cantilever bøying, noe som kan måles, registreres og omdannes til avlesninger av kraft, noe som gir et ikke-invasivt og skalerbar system for måling av kontraktile funksjon in vitro.
Utvikling av mer forutsigbar og biologisk relevante in vitro-analyser forutsetter utvikling av allsidige cellekultursystemer som forenkler funksjonell vurdering av de seeded celler. For dette formål, og tilbyr mikro cantilever teknologi en plattform som brukes til å måle kontraktile funksjonaliteten til en rekke celletyper, inkludert skjelettlidelser, hjerte, og glatte muskelceller, gjennom vurdering av sammentrekning indusert substrat bøying. Anvendelse av multipleksede cantilever matriser gir et middel til å utvikle moderat til høy-throughput-protokoller for å vurdere medikament-effektivitet og toksisitet, sykdoms fenotype og progresjon, samt nevromuskulære og andre celle-celle interaksjoner. Dette manuskriptet gir detaljene for fabrikasjon pålitelige cantilever arrays for dette formålet, og metodene som kreves for å lykkes kultur celler på disse flatene. Nærmere beskrivelse er gitt på de nødvendige skritt for å utføre funksjonelle analysis av kontraktile celletyper opprettholdes på slike matriser ved hjelp av en ny laser og fotodetektorsystemet. De representative data levert høydepunkter presisjonen og reproduserbar naturen av analyse av kontraktile funksjon er mulig ved hjelp av dette systemet, så vel som en lang rekke studier der slik teknologi kan anvendes. Vellykket utbredt bruk av dette systemet kunne gi etterforskere med midler til å utføre raske, lavpris funksjonelle studier in vitro, som fører til mer nøyaktige spådommer om vev ytelse, sykdomsutvikling og respons på romanen terapeutisk behandling.
The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models11.
Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology14, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection15. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.
This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.
De kritiske trinn i å analysere mikrobommene for tegn på celle sammentrekning er plassering av braket brikken i objektbordet, og den etterfølgende justering av laser-og fotodetektoren med spissen av hjørnet bommene i tabellen. Hvis dette ikke gjøres nøyaktig, da programvaren vil være i stand til å ekstrapolere posisjonene til de gjenværende bommene i matrisen, som potensielt kan føre til opphopning av falske negativer under datainnsamling. Operatører bør passe på å sikre at braket chip lå i flukt med bunn…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av National Institute of Health tilskuddsordninger tall R01NS050452 og R01EB009429. Fabrikasjon av braket chips ble utført eksternt av medarbeidere på nanofabrikasjon anlegget ligger ved Cornell University. Alt utstyr som brukes i cantilever fabrikasjon prosessen lå i dette anlegget. Spesiell takk til Mandy Esch og Jean-Matthieu Prot for deres hjelp med cantilever mikro-fabrikasjon. Video animasjon av cantilever funksjonalitet ble generert av Charles Hughes, Alex Zelenin og Eric Imperiale fra Syntetisk Reality Lab ved UCF.
Name of material/ equipment | Company | Catalog number | Comments/ Description |
Primary rat muscle growth medium | |||
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | N/A |
B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ ml |
Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ ml |
Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ ml |
Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ ml |
Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ ml |
Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ ml |
Vascular Endothelial Growth Factor | Life Technologies | P2654 | 20 ng/ ml |
Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ ml |
Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ ml |
Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ ml |
Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ ml |
Primary rat muscle differentiation medium | |||
NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | N/A |
Equipment | |||
Class 2 red diode laser | Newport | N/A | |
Photo-detector | Noah Industries | N/A | |
Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | N/A | |
Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | N/A | |
Patch clamp microscope and stage | Olympus | N/A | |
Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | N/A | |
Axoscope software | Molecular Devices | N/A | |
LabVIEW software | National Instruments | N/A | |
37oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | N/A | |
Class 2 microbiological flow hood | Labconco | N/A | |
Pipettes and tips | Eppendorf | N/A |