Vi beskriver här hur man utför flera elektrod array inspelningar av mänsklig epileptisk kortikal vävnad. Epileptiska vävnad resektion, skiva förberedelse och multielektrod array inspelningar av Interiktal och ictal händelser demonstreras i detalj.
Epilepsi, som drabbar ca 1% av befolkningen, innefattar en grupp av neurologiska störningar kännetecknade av den periodiska förekomsten av krampanfall, som avbryter normal hjärnfunktion. Trots behandling med för närvarande tillgängliga antiepileptiska läkemedel riktar neuronala funktioner, en tredjedel av patienter med epilepsi är pharmacoresistant. I detta tillstånd, kirurgisk resektion av hjärnan området genererar anfall är fortfarande det enda alternativ behandling. Studera mänskliga epileptiska vävnader har bidragit till att förstå nya epileptogena mekanismer under de senaste 10 åren. Faktum är att dessa vävnader genererar spontana Interiktal epileptiska urladdningar samt farmakologiskt inducerad ictal händelser som kan spelas in med klassiska elektrofysiologiska tekniker. Anmärkningsvärt, multielektrodanordningar (MEA), som är mikrofabricerade enheter inbäddning en rad rumsligt arrangerade mikroelektroder, ger en unik möjlighet att samtidigt stimulera och postens fält potentials samt aktionspotentialer av multipla neuroner från olika områden av vävnad. Således MEA inspelningar erbjuder utmärkt metod för att studera spatio-temporala mönster av spontan Interiktal och framkallade krampliknande händelser och mekanismerna bakom anfallsdebut och förökning. Här beskriver vi hur du förbereder humana kortikala skivor från kirurgiskt resekerade vävnad och för att spela in med MEA Interiktal och ictal liknande händelser ex vivo.
Epilepsi är en kronisk sjukdom där epileptiska anfall, vilka är intermittenta mönstrade utsläpp under flera sekunder till tiotals sekunder på elektroencefalografiska (EEG) inspelningar i samband med kliniska manifestationer, avbryta en Interiktal tillstånd, som kännetecknas av närvaron av synkrona neuronala urladdningar varar tiotals millisekunder och kallade Interiktal händelser 1. Det drabbar cirka 1% världens befolkning och även kramper kontrolleras hos majoriteten av patienterna, gör ungefär en tredjedel av personer med epilepsi visar inte lämpligt svar på antiepileptika 2. I detta tillstånd, som kallas pharmacoresistant epilepsi och vars mekanismer fortfarande måste tydligt identifieras, kirurgisk resektion av specifik del av hjärnan identifierats som anfallsdebut zon förblir det enda alternativ behandling som ger ett positivt resultat för patienterna. Således, de utskurna prover från kirurgi ger den möjhet att studera mekanismerna för Interiktal utsläpp och anfallsgenerering och utbredning samt pharmacoresistance på livsduglig vävnad mänsklig centrala nervsystemet ex vivo.
Multi-elektrod arrayer (MEA), som består av ett arrangemang av rumsligt fördelade mikroelektroder, tillåter samtidig stimulering och registrering av elektrofysiologiska aktivitet från flera platser i vävnaden, vilket ger en utmärkt metod för att studera spatio-temporala mönster av spontan och framkallad aktivitet . Denna teknik, tillämpades först för att övervaka utvecklings förändringar i nervcellskultur aktivitet 3 och sedan anpassade för akut och organotypisk hjärna och ryggmärgs skivor 4-6, anses för närvarande ett värdefullt elektroverktyg.
Den nuvarande protokollet beskriver hur man förbereder humana kortikala skivor från kirurgiskt resekerade vävnad och för att spela in med MEA pålitlig ex VIvo Interiktal och krampliknande händelser från dessa skivor. Denna teknik ger alltså ett sätt att ta itu med de grundläggande mekanismerna bakom epileptiska aktiviteter initiering, spridning och följder av antiepileptika hos både via mobil och nätverksnivå. Alla de metoder som används för att inhämta, förbereda, underhålla och spela in mänskliga skivor Här beskrivs i detalj.
Pharmacoresistant epilepsi är ett sällsynt tillstånd, som kan utforskas i mänsklig vävnad in vitro. Detta gör det möjligt att studera epileptiska mänsklig cortex, som visar specifika brister som endast delvis återges i djurmodeller. Metoden beskrivs här låter förbereda och spela in mänskliga postoperativa vävnader ex vivo med bevarad cellulär livsduglighet och nätverk så att de spontant producerar epileptiska aktiviteter. Behålla liknande aktiviteter än de som spelats in vivo är avgörande för att studera mekanismerna för uppkomsten av patologiska aktiviteter. Vidare tillåter sådana metoder att utforska mänskliga vävnader och undvika icke perfekta djurmodeller av sjukdomen. Men studerar mänsklig vävnad kräver synkronisering mellan neurokirurger och experimentellt laboratorium. Vävnads transporter kräver särskild vård inte vara traumatiskt. Dessutom är begränsad både mängden av provet och vävnaden. Slutligen är tillgången till lämpliga kontrollvävnader main oro. Med detta preparat, de postoperativa vävnader spontant producera Interiktal liknande utsläpp vid normal ACSF 7,8. Ictal liknande händelser kan också framkallas i modifierad, prokonvulsiva ACSF så att mekanismerna för anfalls initiering och övergång från Interiktal tillstånd till anfall kan undersökas.
Mänsklig vävnad kan hållas lönsamt för upp till 10 timmar i villkoren vad gäller gränssnitt. Skivor ansågs lönsamt när flera enheter aktivitet eller fältpotentialer observerades spontant och när verksamheten hade framkallat genom att öka retbarhet genom extracellulära kaliumökningar och / eller magnesium minskar. Även variation i aktivitet inträffar sannolikt avspeglar skillnader i sjukdomstillstånd och kortikala områden, vi undersökt epileptogena egenskaper hos en vävnad endast friska skivor visar spontan Interiktal och framkallade ictal utsläpp. För att bevara vävnad vitalitet och aktivitet, är ett gränssnitt kammare används för att lagra tHan skär vid 36-37 ° C för återvinning innan inspelning med MEA-systemet. I själva verket har flera grupper tydligt visat fördelarna gränssnitt baserat lagringssystem jämfört med vanlig bägare lagring och vikten av temperaturen för att bevara nätverksaktivitet av t.ex. spontana skarpa wave-ringar eller kolinerga-inducerade svängningar 9,10. Gränssnitt lagring av skivor har använts tidigare för att spela in epileptisk aktivitet från human hippocampus och subicular skivor 1,11. Med nuvarande MEA tekniken, efter återhämtningsperiod från skivning i villkoren vad gäller gränssnitt, är nätverksaktivitet registreras i nedsänkta förhållanden, i närvaro av högt flöde (5-6 ml / min) vid 37 ° C, med MEA-systemet. Den med reducerad diameter (1,8 cm) med MEA chip, som avgränsar en liten volym kammare (<1,5 ml), tillsammans med den ökade flödeshastigheten, ökar syretillförseln för den del, som har visat sig vara en kritisk faktor för spontan och PHArmacologically inducerad nätverksaktiviteter 9,10. Vidare minskade mängden cirkulerande ACSF underlättar farmakologisk testning.
Skivning Förfarandet är dock en traumatism för vävnaderna 12. Både neuronal arkitektur och klorid homeostas verkar störas vid vävnadsytan (50 pm). Ursprunget för de verksamheter som registreras av MEA marker, vilket prov vävnaden oftast ytligt utan djup penetration, kan uppstå traumatiserade områden. Men våra data visar att de extracellulära fält potentialer detekterade lokalt registreras i de flesta MEA elektroder och tidigare arbete visar att de är integrerade över en 100 till 200 pm avstånd från inspelningsplatsen 13, vilket tyder på att kramper registrerats i våra förberedelser är osannolikt att produceras av traumatiserade områden. Vidare, i studier utförda med volframelektroder som möjliggör djup penetration, de epileptiska verksamhet som registrerats i mänskliga vävnader liknartill dem som observerades hos patienter med epilepsi 1,7,8.
En annan begränsning av ex vivo vävnads inspelning är störningar i förbindelserna mellan de olika hjärnområden, vilket begränsar dynamiska neuromodulations. Detta kan förklara varför i sådan vävnad inte ictal liknande händelse spontant registreras, men kräver att utlösas av jonisk manipulation eller farmakologisk stimulering förbättrar retbarhet. Således i detta protokoll, är krampliknande händelser induceras genom att kombinera en förändring av extracellulärt K + 3-6 mm och en minskning av extern Mg2 + från 1,3 mM till Mg2 + -fri ACSF, för att öka vävnads retbarhet och ta bort Mg 2+ -beroende NMDA-receptorblock. I själva verket har det tidigare visats att epileptiform aktivitet som induceras i humana hjärnbarkens och hippocampus skivor med användning av Mg2 + -fri ACSF liknar de elektrografiska anfall spelats in vivo 14. Dessutom,Det har visats att epileptiforma utsläpp erhållits i tinningloben skivor blir resistenta mot kliniskt använda antiepileptika efter långvarig exponering för Mg2 + -fri ACSF 15,16, vilket ger en modell för att undersöka pharmacoresistant krampliknande händelser in vitro.
MEA tillåter inspelning av båda, fält potentialer och flera enheter verksamhet som består i neuronala aktionspotentialer ex vivo. Således MEA är ett kraftfullt elektro verktyg jämfört med EEGs, som utforskar fält potentialer som genereras av synkrona aktiviteter neuronala ensembler in vivo, men inte ger tillgång till enstaka neuron beteenden 17. Även nyare mikroelektroder kan spela in vivo flera enheter verksamhet som består i neuronala aktionspotentialer, de är invasiva, så deras användning är oftast begränsad till forsknings syfte under intrakraniella inspelningar. Särskilt MEA inspelningar utgör en teknik för valatt studera Ramar mönster av epileptiska händelser, de mekanismer som styr anfallsdebut och spridning och verkan av klassiska och nya antiepileptika. Anmärkningsvärt, att riva upp de celltyper och grunden för epileptiska urladdningar signalering, spik sorteringstekniker och farmakologisk testning bör kombineras med MEA tekniker. Även MEA kan ge tillgång till enskilda spikar, ger de inte information om synaptiska och biofysiska egenskaper. I framtiden bör andra tekniker kopplas till MEA inspelningar för att bättre prov cellulära beteende, nätverksaktiviteter och synaptisk signalering. Till exempel, för att fluorescens avbildning nysta nervceller eller gliaceller beteende samt jon dynamik, kan kombineras med MEA inspelningar. Ytterligare post-hoc histologisk analys kan också avslöja specifika förändringar av celltyper, proteiner eller receptorer, så att placeringen av de epileptiska aktiviteter kan korreleras med specifika omlagringar avnervstrukturen. Den MEA-systemet kan också ingå i en patch-clamp set-up för att korrelera enskilda celler eller konduktanser med befolkningsåtgärder. I framtiden kan optogenetic verktyg också användas, förutsatt att de mänskliga skivor kan odlas på lång sikt, som utförs för organotypiska skivor, så kan genomföras att transfektion eller infektion av specifika celltyper.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från ANR (Programme Blanc neurovetenskap), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), City of Paris (Programme Emergence), INSERM och La Pitié Salpétriéresjukhuset (Translationell forskningsavtal) till NR, från Neuropôle de Recherche Francilien (Nerf) till ED, från Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programme konvergens) och från Institut du Cerveau et e la Mølle epiniere (Paris) till GH
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |