Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Summary

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Abstract

Hoge-resolutie analyse van de morfologie en functie van zoogdierneuronen vereist vaak de genotypering van individuele dieren, gevolgd door de analyse van primaire kweken van neuronen. We beschrijven een reeks procedures voor: het labelen van pasgeboren muizen worden gegenotypeerd, snelle genotypering, en tot oprichting van een lage dichtheid culturen van neuronen in de hersenen van deze muizen. Individuele muizen worden gelabeld door tatoeëren, die zorgt voor langdurige identificatie blijvend in de volwassenheid. Genotypering van het beschreven protocol is snel en efficiënt en maakt geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur goede betrouwbaarheid. Dit is nuttig in omstandigheden waarin voldoende tijd conventionele genotypering niet beschikbaar, bijvoorbeeld in muizen die lijden neonatale sterfte. Primaire neuronale culturen worden gegenereerd bij een lage dichtheid, die beeldvorming experimenten mogelijk maakt bij een hoge ruimtelijke resolutie. Deze cultuur methode vereist de voorbereiding van gliale feeder lagen voorafgaand aan neuronale plating. De pROTOCOL wordt toegepast in zijn geheel een muismodel van de bewegingsstoornis DYT1 dystonie (AE-Torsina knock-in muizen) en neuronale culturen worden bereid uit de hippocampus, cerebrale cortex en striatum van deze muizen. Dit protocol kan worden toegepast op muizen met andere genetische mutaties, alsmede dieren van andere soorten. Verder kunnen de afzonderlijke componenten van het protocol worden gebruikt voor geïsoleerde deelprojecten. Zo zal dit protocol hebben brede toepassingen, niet alleen in de neurowetenschappen, maar ook in andere gebieden van de biologische en medische wetenschappen.

Introduction

Knaagdiermodellen van genetische ziekten nuttig bij het vaststellen van de normale fysiologische functies van eiwitten en nucleïnezuren, en de pathofysiologische gevolgen van defecten in deze bewezen. Voorbeelden omvatten muizen deficiënt voor eiwitten die betrokken zijn bij essentiële cellulaire functies, evenals muismodellen van aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Toch kunnen bepaalde genetische manipulaties leiden tot neonatale sterfte kort of een paar dagen na de geboorte. In deze gevallen primaire celculturen een belangrijk instrument omdat levende cellen kunnen worden verkregen uit de embryonale of neonatale pups voor sterfte kunnen zij gedurende ten minste enkele weken in vitro, en gedurende deze tijd vroege neuronale ontwikkeling kan worden gevolgd door biochemische, functionele en morfologische experimenten. Voor de primaire kweken, kan het voordelig zijn de neuronen bij lage dichtheid plaat; dit maakt het mogelijk de individuele cellichamen, dendrieten, axonale assen en zenuw beëindiging visualiserennals bij hoge ruimtelijke resolutie. De overleving en differentiatie van neuronen bij lage dichtheid vereist gewoonlijk dat ze uitgeplaat op een gliale feeder layer, samen gekweekt met gliale cellen in afwezigheid van fysiek contact met hen, of gekweekt in medium geconditioneerd door glia ^1.

De oprichting van lage dichtheid neuronale culturen gliale feeder lagen kan afhankelijk snelle en betrouwbare genotypering vooraf zijn – binnen een paar uur in tegenstelling tot een paar dagen. Snelheid is vooral belangrijk wanneer de neuronale genotype moet worden aangepast aan die van een gliale feeder layer vooraf voorbereid. Als een praktisch voorbeeld, kan het nodig zijn om te beslissen welke pups waarvan genotype voor gebruik in het genereren culturen, de efficiëntie van een experiment optimaliseren.

Hier laten we zien het werken protocol dat is gebruikt voor een snelle, eenvoudige en betrouwbare muis genotypering in eerdere publicaties ^2-6. Muis staarten eneen commercieel verkrijgbare kit gebruikt. Dit protocol omvat één fase extractie van nucleïnezuren uit het weefsel, en vereist noch een nucleïnezuur zuiveringsstap noch het gebruik van een buffer beëindigd ("stop solution). De betrouwbaarheid van deze genotyperingsmethode illustreert waarin de resultaten van een reeks proeven bij verschillen wordt geïntroduceerd ten opzichte van het uitgangsbedrag van de specimens, de leeftijd van de dieren en de lengte van de PCR amplicons. Deze kit biedt de voordelen van geautomatiseerde extractie en betrouwbaarheid.

Omwille van zijn uitgebreid, wordt het gebruik van tatoeage voor identificatie van het genotype muizen lange termijn eveneens aangetoond. Tatoeage wordt bereikt door tatoeage inkt naar de dermis van de huid (onder de epidermis) ^7. Een werkwijze wordt beschreven voor het tatoeëren de voetzolen van pasgeboren of 1 dag oude muizen, hoewel tatoeages kunnen worden toegepast op andere delen van het lichaam, zoals staarten en tenen, en Animals van alle leeftijden. Bovendien zullen procedures worden aangetoond plateren en kweken muis neuronen bij een lage dichtheid, gebaseerd op geoptimaliseerde bereiding van verschillende gliale feeder lagen ^2,8.

We maken gebruik van een genetische muismodel van de erfelijke neurologische aandoening DYT1 dystonie – een autosomaal-dominante stroming aandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. Het gecodeerde eiwit, Torsina, behoort tot de "ATPasen geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten" (AAA +) familie van eiwitten, waarvan de leden doorgaans uitgevoerd chaperone-achtige functies, assisteren in: eiwitontvouwende, eiwit-complex demontage, membraantransport en vesikel fusie ^10-13. De mutatie leidt tot een in-frame deletie van een codon voor glutaminezuur, en kan leiden tot manifestatie van "early-onset algemene geïsoleerd dystonie ^'14,15. De padophysiological mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze aandoening blijven slecht begrepen. In een knock-in muismodel, de mutant allel is Tor1a ^tm2Wtd, hierna genoemd als Tor1a ^AE. Heterozygote AE-Torsina knock-in muizen zijn levensvatbaar en genetisch bootsen menselijke patiënten met DYT1 dystonie, terwijl homozygote knock-in muizen na de geboorte sterven ^16,17, met de latency tot postnatale dood beïnvloed door genetische achtergrond ^18. De vroege dood van homozygote knock-in muizen noodzakelijk dat zowel de genotypering van dieren en de instelling van neuronale kweken snel voltooid. Als een ander voorbeeld van genotypering, Tfap2a (transcriptiefactor AP-2α activerende enhancer bindend eiwit 2α) gebruikt. De proteïne gecodeerd door dit gen is belangrijk bij het ​​reguleren meerdere cellulaire processen, zoals proliferatie, differentiatie, overleving en apoptose ^19.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures uitgevoerd in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa. 1. Langdurig Identificatie van Muizen met behulp Tatoeëren de voetzolen Immobiliseren een poot met de poot pad (voetzool) tegenover de experimentator. Houd de poot met de duim en de wijsvinger. Wees voorzichtig de poot niet bekneld raken. OPMERKING: Stabiele immobilisatie is belangrijk dat de tatoeage pigment …

Representative Results

Als voorbeeld van de toepassing van dit protocol, worden representatieve resultaten getoond voor het labelen van muizen door tatoeëren, betrouwbare genotypering onder verschillende experimentele omstandigheden, en tot vaststelling van primaire neuronale culturen op gliale feeder lagen. Tatoeëren Pasgeboren pups werden bestempeld op de voetzolen met een tatoeage systeem ('Newborn' in figuur 1). De etiketten blijft zichtb…

Discussion

The protocol presented here includes procedures for tattooing to label/identify mice, for genotyping mice from tail tips, and for culturing mouse brain neurons at low density. In one round of experiments using 6-8 pups, these procedures typically require ~0.5 hr, ~4 hr and ~2 hr, respectively, at a total of 6-7 hr. This makes it practical for a single experimenter to complete all the procedures necessary from the time of the pups' birth to the plating of neuronal cultures – in less than a single working day (wi…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015